• facebook
  • ti sopọ mọ
  • youtube

Imọ-ẹrọ iwadii molikula nlo awọn ọna isedale molikula lati ṣe awari ikosile ati eto ti ohun elo jiini ti ara eniyan ati ọpọlọpọ awọn aarun ayọkẹlẹ, lati le ṣaṣeyọri idi ti asọtẹlẹ ati iwadii aisan.

Ni awọn ọdun aipẹ, pẹlu iṣagbega ati aṣetunṣe ti imọ-ẹrọ iwadii molikula, ohun elo ile-iwosan ti awọn iwadii molikula ti di pupọ ati siwaju sii ati ni ijinle, ati ọja iwadii molikula ti wọ akoko idagbasoke iyara.

Onkọwe ṣe akopọ awọn imọ-ẹrọ iwadii molikula ti o wọpọ lori ọja, ati pe o pin si awọn ẹya mẹta: apakan akọkọ ṣafihan imọ-ẹrọ PCR, apakan keji ṣafihan imọ-ẹrọ imudara isothermal nucleic acid, ati apakan keji ṣafihan imọ-ẹrọ atẹle.

01

Apá I: PCR Technology

PCR ọna ẹrọ

PCR (iṣafihan pq polymerase) jẹ ọkan ninu awọn imọ-ẹrọ imudara DNA in vitro, pẹlu itan-akọọlẹ ti o ju ọgbọn ọdun lọ.

Imọ-ẹrọ PCR jẹ aṣaaju-ọna ni 1983 nipasẹ Kary Mullis ti Cetus, AMẸRIKA.Mullis beere fun itọsi PCR ni ọdun 1985 o si ṣe atẹjade iwe ẹkọ PCR akọkọ lori Imọ ni ọdun kanna.Mullis gba Ebun Nobel ninu Kemistri ni ọdun 1993.

Awọn ilana ipilẹ ti PCR

PCR le ṣe alekun awọn ajeku DNA ibi-afẹde nipasẹ diẹ sii ju awọn akoko miliọnu kan lọ.Ilana naa ni pe labẹ catalysis ti DNA polymerase, DNA okun obi ni a lo bi awoṣe, ati pe a lo alakoko kan pato bi aaye ibẹrẹ fun itẹsiwaju.O jẹ atunṣe ni fitiro nipasẹ awọn igbesẹ bii denaturation, annealing, ati itẹsiwaju.Ilana ti okun ọmọbinrin DNA tobaramu si awọn obi okun awoṣe DNA.

1

Ilana PCR boṣewa ti pin si awọn igbesẹ mẹta:

1. Denaturation: Lo iwọn otutu giga lati ya awọn okun meji DNA lọtọ.Awọn asopọ hydrogen laarin awọn okun meji DNA ti bajẹ ni awọn iwọn otutu giga (93-98°C).

2. Annealing: Lẹhin ti DNA ti o ni ilọpo meji ti yapa, iwọn otutu ti wa ni isalẹ ki alakoko le so mọ DNA ti o ni ẹyọkan.

3. Ifaagun: DNA polymerase bẹrẹ lati ṣajọpọ awọn okun ibaramu pẹlu awọn okun DNA lati awọn alakoko ti a dè nigbati iwọn otutu ba dinku.Nigbati itẹsiwaju ba ti pari, iyipo kan ti pari, ati nọmba awọn ajẹkù DNA ni ilọpo meji.

Ni atunṣe awọn igbesẹ mẹta wọnyi ni igba 25-35, nọmba awọn ajẹkù DNA yoo pọ si ni afikun.

2

Ọgbọn ti PCR ni pe awọn alakoko oriṣiriṣi le ṣe apẹrẹ fun oriṣiriṣi awọn jiini ibi-afẹde, ki awọn ajẹrun jiini ibi-afẹde le jẹ alekun ni igba diẹ.

Lọwọlọwọ, PCR le pin si awọn ẹka mẹta, eyun PCR lasan, PCR pipo fluorescent ati PCR oni-nọmba.

Ni igba akọkọ ti iran ti arinrin PCR

Lo ohun elo imudara PCR lasan lati mu jiini ibi-afẹde pọ si, lẹhinna lo agarose gel electrophoresis lati ṣawari ọja naa, itupalẹ agbara nikan le ṣee ṣe.

Awọn aila-nfani akọkọ ti PCR iran akọkọ:

-Prone si ti kii-kan pato ampilifaya ati eke rere esi.

-Iwari naa gba akoko pipẹ ati pe iṣẹ naa jẹ ẹru.

-Awọn idanwo didara nikan ni a le ṣe.

PCR pipo fluorescence iran-keji

Fluorescence pipo PCR (Real-Time PCR), ti a tun mọ ni qPCR, ni a lo lati ṣe atẹle ikojọpọ awọn ọja ti o pọ si nipasẹ ikojọpọ ti awọn ifihan agbara fluorescent nipa fifi awọn iwadii fluorescent kun ti o le tọka si ilọsiwaju ti eto ifa, ati lati ṣe idajọ awọn abajade nipasẹ igbi fluorescence, ati pe O le ṣe iṣiro iye iwọn ati iwọn iranlọwọ ti iwọn pẹlu iwọn iranlọwọ.

Nitoripe imọ-ẹrọ qPCR ni a ṣe ni eto pipade, iṣeeṣe ti ibajẹ ti dinku, ati pe ifihan agbara fluorescence le ṣe abojuto fun wiwa titobi, nitorinaa o jẹ lilo pupọ julọ ni adaṣe ile-iwosan ati pe o ti di imọ-ẹrọ ti o ga julọ ni PCR.

Awọn oludoti Fuluorisenti ti a lo ninu PCR pipo Fuluorisenti gidi-gidi ni a le pin si: Awọn iwadii fluorescent TaqMan, awọn beakoni molikula ati awọn awọ fluorescent.

1) Iwadi fluorescent TaqMan:

Lakoko imudara PCR, iwadii fluorescent kan pato ni a ṣafikun lakoko fifi awọn alakoko meji kun.Iwadii naa jẹ oligonucleotide, ati awọn opin meji naa ni aami lẹsẹsẹ pẹlu ẹgbẹ fluorescent onirohin ati ẹgbẹ fluorescent quencher.

Nigbati iwadii ba wa ni mule, ifihan Fuluorisenti ti o jade nipasẹ ẹgbẹ onirohin ti gba nipasẹ ẹgbẹ quenching;nigba PCR ampilifaya, awọn 5'-3' exonuclease aṣayan iṣẹ-ṣiṣe ti Taq henensiamu cleaves ati degrades awọn iwadi, ṣiṣe awọn onirohin Fuluorisenti ẹgbẹ ati quencher Ẹgbẹ Fuluorisenti ti yapa, ki awọn fluorescence monitoring eto le gba awọn fluorescence ifihan agbara, ti o ni, ni gbogbo igba ti a okun DNA ti wa ni amúṣantóbi ti, a fluorescent ifihan agbara ti wa ni akoso patapata ati fluorescent ifihan agbara. pẹlu awọn Ibiyi ti PCR ọja.

2) Awọn awọ fluorescent SYBR:

Ninu eto ifasilẹ PCR, iyọkuro ti awọ Fuluorisenti SYBR ti wa ni afikun.Lẹhin ti SYBR Fuluorisenti dye ti wa ni ti kii-ni pato dapọ si DNA ni ilopo-okun, o njade lara ifihan Fuluorisenti.Molikula dye SYBR ti ko dapọ si pq kii yoo ṣe itusilẹ eyikeyi ifihan agbara Fuluorisenti, nitorinaa aridaju ifihan agbara Fuluorisenti Ilọsoke ninu awọn ọja PCR jẹ mimuuṣiṣẹpọ patapata pẹlu ilosoke ninu awọn ọja PCR.SYBR nikan sopọ mọ DNA ti o ni ilopo-meji, nitorinaa iyipo yo le ṣee lo lati pinnu boya iṣesi PCR jẹ pato.

3 4

3) Molecular beakoni

O jẹ itọka oligonucleotide ti o ni aami-meji ti o ni itọka ti stem-loop ti o ṣe apẹrẹ irun ti o fẹrẹ to awọn ipilẹ 8 ni awọn opin 5 ati 3.Awọn itọsẹ acid nucleic ni awọn opin mejeeji ni a so pọ ni ibamu, ti o nfa ki ẹgbẹ Fuluorisenti ati ẹgbẹ quenching naa ṣinṣin.Pade, kii yoo ṣe agbejade fluorescence.

5

Lẹhin ti ọja PCR ti ṣe ipilẹṣẹ, lakoko ilana isọdọkan, apakan aarin ti beakoni molikula ni a so pọ pẹlu ọkọọkan DNA kan pato, ati pe jiini Fuluorisenti ti yapa kuro ninu apilẹṣẹ quencher lati gbejade fluorescence.

6

Awọn aila-nfani akọkọ ti PCR-keji:

Ifamọ ṣi ṣi, ati wiwa awọn apẹẹrẹ ẹda-kekere kii ṣe deede.

Ipa iye isale wa, ati abajade jẹ ifaragba si kikọlu.

Kẹta iran oni PCR

PCR oni-nọmba (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ṣe iṣiro nọmba ẹda ti ọkọọkan ibi-afẹde nipasẹ wiwa ipari-ojuami, ati pe o le ṣe wiwa wiwa pipo deede laisi lilo awọn iṣakoso inu ati awọn ilọpa boṣewa.

PCR oni-nọmba nlo wiwa ipari ipari ati pe ko dale lori iye Ct (alapade ọmọ), nitorinaa iṣesi PCR oni-nọmba ko ni ipa nipasẹ ṣiṣe imudara, ati ifarada si awọn inhibitors ifa PCR ti ni ilọsiwaju, pẹlu iṣedede giga ati atunṣe.

Nitori awọn abuda ti ifamọ giga ati iṣedede giga, ko ni irọrun ni irọrun nipasẹ awọn inhibitors ifaseyin PCR, ati pe o le ṣaṣeyọri iwọn pipe otitọ laisi awọn ọja boṣewa, eyiti o ti di aaye iwadii ati ohun elo.

Gẹgẹbi awọn ọna oriṣiriṣi ti ẹya ifaseyin, o le pin si awọn oriṣi mẹta: microfluidic, chirún ati awọn eto droplet.


Akoko ifiweranṣẹ: Jul-08-2021