1. Ṣe awari gbigba ti ojutu RNA
Absorbance ni 280, 320, 230, ati 260 nm duro fun awọn iye ti nucleic acid, lẹhin (ojutu turbidity), ifọkansi iyọ, ati ohun elo Organic gẹgẹbi amuaradagba, lẹsẹsẹ.Ni gbogbogbo nikan wo OD260/OD280 (Ratio, R).Nigbati 1.8 ~ 2.0, a ro pe idoti ti amuaradagba tabi awọn ohun elo Organic miiran ni RNA le jẹ ki o farada, ṣugbọn o yẹ ki o ṣe akiyesi pe nigba lilo Tris bi ifipamọ lati ṣawari ifasimu, iye R le jẹ tobi ju 2 (ni gbogbogbo o yẹ ki o jẹ <2.2).Nigbati R<1.8, idoti ti amuaradagba tabi awọn ohun elo Organic miiran ninu ojutu jẹ diẹ sii kedere, ati pe ayanmọ ti RNA le pinnu ni ibamu si awọn iwulo.Nigbati R> 2.2, o tumọ si pe RNA ti jẹ hydrolyzed sinu acid nucleic kan.
2.Electrophoretic Àpẹẹrẹ ti RNA
Ni gbogbogbo, geli denaturing ti wa ni lilo fun RNA electrophoresis, ṣugbọn ti o ba jẹ nikan fun wiwa awọn didara ti RNA, denaturing jeli jẹ ko wulo, ati awọn arinrin agarose jeli le ṣee lo.Idi ti electrophoresis ni lati ṣe awari iduroṣinṣin ti awọn ẹgbẹ 28S ati 18S ati ipin wọn, tabi iduroṣinṣin ti smear mRNA.Ni gbogbogbo, ti awọn ẹgbẹ 28S ati 18S ba ni imọlẹ, ko o, ati didasilẹ (itọkasi awọn egbegbe ti awọn ẹgbẹ jẹ kedere), ati imọlẹ ti 28S jẹ diẹ sii ju ilọpo meji ti ẹgbẹ 18S, a ro pe didara RNA dara.
Awọn ọna ti o wa loke ni awọn ọna meji ti a lo nigbagbogbo, ṣugbọn ko si ninu awọn ọna meji wọnyi ti o le sọ fun wa ni kedere boya RNase to ku wa ninu ojutu RNA.Ti iye kekere ti RNase ba wa ninu ojutu, o nira fun wa lati rii pẹlu ọna ti o wa loke, ṣugbọn pupọ julọ awọn aati enzymatic ti o tẹle ni a ṣe ni awọn iwọn 37 ati fun igba pipẹ.Ni ọna yii, ti iye kekere ti RNase ba wa ninu ojutu RNA, lẹhinna agbegbe ti o dara pupọ yoo wa ati akoko lati ṣe ipa wọn ninu awọn adanwo ti o tẹle, ati pe dajudaju idanwo naa yoo tutu ni akoko yii.Ni isalẹ a ṣafihan ọna kan ti o le jẹrisi boya RNase to ku wa ninu ojutu RNA.
3. Ooru itoju igbeyewo
Gẹgẹbi ifọkansi ayẹwo, fa meji 1000 ng RNA lati ojutu RNA ki o ṣafikun si tube centrifuge 0.5 milimita, ki o ṣe afikun pẹlu pH 7.0 Tris saarin si iwọn didun lapapọ ti 10 ul, ati lẹhinna di fila ti tube naa.Fi ọkan ninu wọn sinu iwẹ omi ni iwọn otutu igbagbogbo ni 70 ° C ki o jẹ ki o gbona fun wakati kan.Apa keji ti wa ni ipamọ ninu firiji -20 ° C fun wakati kan.Nigbati akoko ba pari, yọ awọn ayẹwo meji fun electrophoresis kuro.Lẹhin ti awọn electrophoresis ti wa ni ti pari, afiwe awọn electrophoretic igbohunsafefe ti awọn meji.Ti awọn ẹgbẹ mejeeji ba ni ibamu tabi ko ni iyatọ pataki (dajudaju, awọn ẹgbẹ wọn tun pade awọn ipo ni ọna 2), o tumọ si pe ko si ibajẹ RNase to ku ninu ojutu RNA, ati pe didara RNA dara pupọ.Ni ilodi si, ti ayẹwo ba wa ni 70°C ṣe afihan ibajẹ ti o han gbangba, o tọkasi pe ibajẹ RNase wa ninu ojutu RNA.
2 Awọn ọna idanwo ati awọn ilana fun isediwon RNA
Awọn iṣoro ti a nigbagbogbo ba pade nigba yiyọ RNA jade ni: (1) ikore RNA kere;(2) RNA ni o ni pataki iyo idoti;(3) RNA ni o ni pataki Organic epo idoti;(4) ibajẹ ayẹwo ati awọn iṣoro miiran
1. Commonly lo lapapọ RNA isediwon reagents
Ọna isothiocyanate guanidine ati ọna Trizol jẹ awọn ọna ti o wọpọ julọ ti a lo fun isediwon RNA lapapọ lati awọn ẹran ara ẹranko ati awọn sẹẹli ẹranko.O dara ni pataki fun awọn ayẹwo kekere ati awọn tisọ ti o nira pupọ lati jade, gẹgẹ bi isediwon RNA lapapọ lati awọ ehoro ati ẹran ara asopọ;ni afikun, Trizol, bi a gbogboogbo-idi lysis reagent, tun le ṣee lo fun isediwon ti ọgbin tissues, kokoro arun, elu ati awọn miiran tissues.Fun awọn ohun elo ọgbin ti o ni awọn polysaccharides ati awọn polyphenols, gẹgẹbi camellia oleifera, leaves tii, ifipabanilopo, ati bẹbẹ lọ, ọna CTAB tun le ṣee lo lati yọkuro RNA lapapọ.
Gẹgẹbi ọna ti aṣa, ọna iwe-meji tun jẹ olokiki pupọ nitori iṣiṣẹ iwọn otutu deede rẹ, ko si iwulo lati ṣafikun RNase, ati ailewu — ko si chloroform, phenols ati awọn reagents Organic miiran fun isediwon.(niyanju awọn ọja )
2. Isediwon ti lapapọ RNA lati eranko tissues
(1) Gbiyanju lati yan àsopọ titun, ti ko ba jẹ alabapade (pelu laarin osu mẹta - 80 ℃ firiji tabi tio tutunini ni omi nitrogen. Nigbati o ba ge àsopọ, ma ṣe ge taara ni iwọn otutu yara, rii daju pe o fi sii lori yinyin apoti, gbiyanju lati yago fun didi ati thawing tun.
(2) Lo awọn scissors mimọ ati awọn tweezers lati ge nkan kekere ti àsopọ, gbiyanju lati ge apakan aarin ti àsopọ nigbati o ba ge ayẹwo naa, tabi kọkọ ge nkan nla ti àsopọ lati aarin, lẹhinna ge ayẹwo ni ipo lila tuntun.Aṣọ ti a ti yọ kuro yẹ ki o wa ni kikun, fi awọ-ara ti a fi silẹ sinu tube EP kan laisi RNase, fi lysate naa kun, awọ-ara ti a fi silẹ yẹ ki o wa ni kikun si lysate, ki o si mura fun isokan.
(3) Fun awọn tissu deede, yan mung bean-sized tissues (30-60 mg) fun isokan.Ti awọn tisọ ba ni iye nla ti amuaradagba, ọra, tabi awọn tissu fibrous ipon gẹgẹbi ẹdọ, mu daradara tabi dinku iye awọn tisọ ge (iyan) Yan 10 ~ 20 mg).
(4) Ti iṣan ẹja, ẹran ede, jellyfish ati awọn tissu miiran ti o ni akoonu ti o ga julọ ti fa jade, iwọn didun ayẹwo yẹ ki o pọ sii daradara (100-200 mg ti a ṣe iṣeduro).
(5) Ti awọn ipo ba gba laaye, ẹran ara ẹranko le fa jade taara lẹhin ti o jẹ isokan pẹlu homogenizer àsopọ ti o ga, ti ko ba si iru ẹrọ bẹẹ.
(6) RNA ti o gba lẹhin isediwon ipari gbọdọ wa ni gbe sori apoti yinyin lẹsẹkẹsẹ lati dinku ibajẹ ti RNA.
3. Animal cell RNA isediwon
(1) Awọn sẹẹli idadoro: centrifuge taara ki o sọ alabọde silẹ, wẹ pẹlu PBS aifọkanbalẹ fun awọn akoko 1-2, lẹhinna daduro pẹlu iye PBS ti o yẹ, ati lẹhinna ṣafikun lysate fun lysis.Ma ṣe ṣafikun lysate taara si awọn sẹẹli ti o ṣaju lẹhin ti o da omi bibajẹ silẹ patapata.Eyi yoo jẹ ki apopọ histone ti a tu silẹ lẹhin awọn sẹẹli lysed ti o wa ni ita lati faramọ ita ti awọn sẹẹli ti o ṣaju, nitorinaa diwọn olubasọrọ ti awọn sẹẹli inu pellet pẹlu lysate., Abajade ni aipe cell lysis ati dinku RNA ikore.
(2) Awọn sẹẹli ti o jẹ ologbele-adherent tabi ti ko ni ifaramọ ni wiwọ: Lẹhin sisọ alabọde naa, wẹ pẹlu PBS fun awọn akoko 1-2, lẹhinna fa taara ni iye PBS ti o yẹ ki o fẹ satelaiti aṣa pẹlu pipette tabi ibon lati fẹ pa awọn sẹẹli naa, ki o gbe wọn lọ si awọn sẹẹli ti ko ni RNA.Fi lysate kun si tube EP ti enzymu fun isediwon.
(3) Awọn sẹẹli ti o tẹle: nilo lati wa ni digested pẹlu trypsin akọkọ, lẹhinna gba sinu awọn tubes EP ti ko ni RNase, centrifuged lati yọ supernatant kuro, wẹ awọn akoko 1-2 pẹlu PBS lati yọkuro trypsin pupọ, ati tun pada pẹlu iye ti o yẹ ti PBS Lẹhinna tẹsiwaju si igbesẹ isediwon.
4. Ọgbin RNA isediwon
Awọn ara ohun ọgbin jẹ ọlọrọ ni awọn agbo ogun phenolic, tabi ọlọrọ ni polysaccharides, tabi ni diẹ ninu awọn metabolites Atẹle ti a ko mọ, tabi ni iṣẹ giga ti RNase.Awọn nkan wọnyi ni idapo ni wiwọ pẹlu RNA lẹhin sẹẹli lysis lati ṣe awọn eka insoluble tabi awọn precipitates colloidal, eyiti o nira lati yọkuro.Nitorinaa, nigba ti a ba yọ ohun elo ọgbin jade, a nilo lati yan ohun elo kan fun awọn irugbin.Awọn lysate ninu ohun elo le yanju awọn iṣoro ti irọrun ifoyina ti polyphenols ati iyapa ti awọn agbo ogun polysaccharide ati awọn acids nucleic.
(Fun isediwon ọgbin RNA polysaccharide polyphenol, awọn ọja ti a ṣeduro:
(1) Peeli, pulp, awọn irugbin, awọn ewe, ati bẹbẹ lọ ti ọgbin naa yẹ ki o wa ni ilẹ ni kikun ninu amọ.Lakoko ilana lilọ, omi nitrogen yẹ ki o tun kun ni akoko lati yago fun yo ayẹwo naa.Ayẹwo ilẹ yẹ ki o yara ni kiakia si lysate ati gbigbọn lati yago fun ibajẹ RNA.
(2) Fun awọn ayẹwo ọlọrọ fiber gẹgẹbi iresi ati awọn ewe alikama, iye isediwon yẹ ki o dinku ni deede, bibẹẹkọ lilọ tissu ati lysis kii yoo pari, ti o mu abajade kekere ti RNA jade.
(3) Fun awọn ohun elo ọgbin pẹlu akoonu omi ti o ga, gẹgẹbi eso pomegranate, eso elegede, eso pishi, ati bẹbẹ lọ, iwọn ayẹwo yẹ ki o pọ si ni deede (100-200 mg jẹ aṣayan).
(4) Awọn tissu ọgbin, gẹgẹbi awọn ewe ọgbin, awọn rhizomes, awọn eso lile ati awọn ohun elo miiran ni gbogbogbo ni a gbaniyanju lati lo nitrogen olomi lati amọ awọn eroja ti o wa ninu amọ-lile daradara, ati lẹhinna tẹsiwaju si igbesẹ isediwon.Mora àsopọ homogenizers le ko ni le munadoko ninu homogenizing ọgbin tissues, ki o si ti wa ni gbogbo ko niyanju.
5. Awọn iṣọra fun isediwon RNA
(1) Awọn ayẹwo iṣan yẹ ki o jẹ tuntun bi o ti ṣee ṣe lati yago fun didi ati gbigbo leralera.
(2) Àsopọ̀ náà gbọ́dọ̀ jẹ́ ilẹ̀ ní kíkún lákòókò ìsokọ́ra, àti iye àsopọ̀ kò yẹ kí ó kéré jù, kí ó jẹ́ pé ó pọ̀ jù.
(3) Akoko ifunmọ to yẹ yẹ ki o fun lẹhin fifi lysate kun lati lyse ayẹwo ni kikun.
(4) Nigbati o ba nlo ọna Trizol fun isediwon, ilana ti gbigba supernatant lẹhin stratification jẹ "yanfẹ lati fa simu ti o kere ju ifasimu diẹ sii", ati pe ko gbọdọ jade lọ si ipele aarin, bibẹẹkọ o yoo fa ibajẹ DNA jiini to ṣe pataki.
(5) Nigbati o ba n fọ, omi fifọ yẹ ki o wọ inu kikun ni ayika ogiri tube lati rii daju fifọ ni kikun.
(6) Fun ọna isediwon ọwọn, ni afikun si yiyọ ọwọn lẹhin fifọ, iwe adsorption yẹ ki o tun gbe sinu ibujoko ti o mọ ultra ati ki o fẹ fun awọn iṣẹju 5-10 lati yọkuro epo Organic ni kikun si gbigbẹ.
(7) Ni igbejade ti o kẹhin ti ọna ọwọn, lẹhin fifi omi DEPC kun, o yẹ ki o wa fun iṣẹju 3-5, tabi omi DEPC yẹ ki o gbona si 60 ° C ni ilosiwaju lati mu ikore elution sii.Ni aṣa Trizol cleavage ati ọna ojoriro isopropanol, RNA ti o kẹhin ti wa ni tituka ni omi DEPC, nitorinaa akoko ti o yẹ yẹ ki o funni fun itu, ati isalẹ ti tube centrifuge yẹ ki o jẹ fifun nigbagbogbo pẹlu ipari pipette kan.
3 Three Awọn okunfa ati awọn solusan fun ifọkansi RNA kekere / didara ko dara
1. Awọn ikore jẹ ju kekere
Apeere ti a fa jade ti lọ silẹ pupọ, iye lapapọ ko to, tabi ayẹwo ti o jade jẹ pupọ ati pe lysis ko pari;awọn àsopọ tabi awọn sẹẹli ti didara ti o yẹ yẹ ki o lo fun isediwon, iṣaju-itọju ti ayẹwo gbọdọ ṣee ṣe daradara, ati pe lysis yẹ ki o to.
2. Genom iṣẹku
Nigbati o ba n yọkuro nipasẹ ọna Trizol, nigbati a ba fa supernatant sinu Layer aarin lẹhin fifin, ibajẹ genome pataki yoo fa;afikun itọju yẹ ki o wa ni ya nigba Layer lati yago fun famu sinu aarin Layer.Ti o ba ti lo ọna ọwọn fun isediwon, ohun elo ti o ni DNAse I le ṣee yan fun isediwon.Awọn nucleic acid adsorbed lori awo ilu ti wa ni digested taara pẹlu DNase I, eyi ti o le din pupọ DNA iṣẹku.
3. RNA ibajẹ
O le jẹ ibajẹ ti apẹẹrẹ ti o jade funrararẹ, tabi ibajẹ ti o ṣẹlẹ lakoko ilana isediwon;bi o ti ṣee ṣe, awọn ayẹwo titun yẹ ki o lo fun isediwon RNA, ati pe awọn ayẹwo ti a gba yẹ ki o wa ni ipamọ ni nitrogen olomi tabi -80 ° C firiji ni akoko, ati didi tun ati thawing yẹ ki o yago fun.Awọn imọran ọfẹ RNase/DNase, awọn tubes centrifuge ati awọn ohun elo miiran yẹ ki o lo ninu ilana isediwon RNA.Ilana isediwon yẹ ki o yara bi o ti ṣee.RNA ti o jade yẹ ki o gbe sori apoti yinyin ki o tọju ni -80 ni akoko.Ti RNA ti a fa jade nilo lati rii nipasẹ gel electrophoresis, electrophoresis yẹ ki o ṣee ṣe lẹsẹkẹsẹ lẹhin isediwon, ati pe o yẹ ki o paarọ imudani electrophoresis pẹlu ọkan ti a pese silẹ tuntun.
4. Iyo ati Organic epo awọn iṣẹku
Awọn reagents isediwon ni phenol ati awọn iyọ guanidine, ati ojutu fifọ ni ethanol ninu.Lakoko ilana isediwon, lysate ko gba patapata ati sọnu, ati pe ojutu fifọ ko gbẹ ni kikun.Awọn iyọ ti o ku ati awọn olomi Organic jẹ ipalara si transcription ti o tẹle ati PCR.Awọn iwọn oriṣiriṣi ti idinamọ, nitorinaa lysate tissu yẹ ki o yọkuro ni kikun lakoko ilana isediwon, ati fifọ yẹ ki o to ki awọn odi agbegbe ti tube le fọ.Ni afikun, tube ti wa ni ofo ati fifun jẹ igbesẹ ti o yẹ, eyi ti yoo tun dinku awọn iyokù ti awọn ohun elo ti ara.
Fun alaye diẹ sii nipa isediwon RNA, jọwọ tẹle oju opo wẹẹbu wa:
www.foreivd.com fun alaye siwaju sii.
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu kejila-01-2022
