COVID-19 jẹ arun ajakalẹ-arun ti o fa nipasẹ Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus Type 2. Nigbati eniyan ba ni akoran, awọn ami aisan ti o wọpọ julọ pẹlu iba, Ikọaláìdúró, ati kikuru ẹmi.

Awọn ayẹwo ti a lo fun idanwo ni a le gba nipasẹ nasopharyngeal swabs tabi oropharyngeal swabs.

Kini PCR?

Ọna boṣewa ti wiwa coronavirus jẹ iṣesi pq polymerase, PCR.Eyi jẹ ọna ti o gbajumo ni lilo ninu isedale molikula.O le yara da awọn miliọnu si awọn ọkẹ àìmọye ti awọn ajẹkù DNA kan pato.

Coronavirus tuntun naa ni jiini RNA kan ti o gun pupọ.Lati le rii awọn ọlọjẹ wọnyi nipasẹ PCR, awọn ohun elo RNA gbọdọ yipada si awọn ilana DNA ibaramu wọn nipasẹ yiyipada transcriptase, ati lẹhinna DNA tuntun ti a ṣepọ le jẹ imudara nipasẹ awọn ilana PCR boṣewa, eyiti a mọ ni gbogbogbo si RT-PCR.

RT-PCR ilana

RNA isediwon

Lati ṣe ọna yii, gbogun ti RNA yẹ ki o fa jade ni ipilẹ.Orisirisi awọn ohun elo isọdọmọ RNA le ṣee lo fun irọrun, iyara ati iyapa to munadoko.

Lati jade gbogun ti RNA nipa lilo ohun elo iṣowo, akọkọ ṣafikun ayẹwo si tube microcentrifuge kan lẹhinna dapọ pẹlu ifipamọ lysis.Ifipamọ yii jẹ denatured gaan ati nigbagbogbo ni phenol ati guanidine isothiocyanate.Ni afikun, awọn inhibitors RNase nigbagbogbo wa ninu ifipamọ lysis lati rii daju ipinya ti RNA gbogun ti aifọwọyi.

Lẹhin fifi ifipamọ lysis kun, vortex tube dapọ nipasẹ pulse ati incubate ni iwọn otutu yara.Kokoro naa lẹhinna lysed labẹ awọn ipo aibikita pupọ ti a pese nipasẹ ifipamọ lysis.

Lẹhin ti awọn ayẹwo ti wa ni lysed, a centrifuge tube ti lo fun awọn ìwẹnumọ ilana.Ayẹwo ti wa ni ti kojọpọ sinu tube centrifuge ati lẹhinna centrifuged.

Ilana yii jẹ ọna isediwon alakoso ti o lagbara ninu eyiti ipele iduro ni matrix gel silica kan.

Labẹ iyọ ti o dara julọ ati awọn ipo pH, awọn ohun elo RNA sopọ mọ awọ ara silica.

Ni akoko kanna, awọn amuaradagba ati awọn idoti miiran ti yọ kuro.

Lẹhin centrifugation, fi tube centrifuge sinu tube gbigba ti o mọ, sọ iyọdanu naa silẹ, lẹhinna ṣafikun ifipamọ fifọ.

Fi tube sinu centrifuge lẹẹkansi lati fi ipa mu ifiminu fifọ nipasẹ awo ilu.Eyi yoo yọ gbogbo awọn idoti ti o ku kuro ninu awọ ara ilu, nlọ nikan RNA ti o so mọ gel silica.

Lẹhin ti a ti fọ ayẹwo naa, fi tube sinu tube microcentrifuge ti o mọ ki o si fi ifipamọ elution kun.

Lẹhinna o wa ni centrifuged lati fi ipa mu ifipamọ elution nipasẹ awọ ara ilu.Ifipamọ elution yọ RNA gbogun ti kuro lati ọwọn iyipo ati gba RNA ti a sọ di mimọ laisi awọn ọlọjẹ, awọn inhibitors, ati awọn idoti miiran.

Igbesẹ 2

Idojukọ adalu

Lẹhin ti o yọkuro RNA gbogun ti, igbesẹ ti n tẹle ni lati mura adalu esi fun imudara PCR.Ni ipele yii, a ti lo ifọkansi.Ojutu ifọkansi yii jẹ ojuutu iṣaju iṣaju ti o ni premix kan, yiyipada transcriptase, awọn nucleotides, alakoko iwaju, alakoko yiyipada, iwadii TaqMan ati polymerase DNA.

Nikẹhin, lati pari adalu ifaseyin yii, awoṣe RNA ti wa ni afikun.Awọn tubes ti wa ni idapo nipasẹ pulse vortexing, ati ki o si awọn lenu adalu ti wa ni ti kojọpọ sinu PCR awo.Awo PCR nigbagbogbo ni awọn kanga 96 ati pe o le ṣe itupalẹ ọpọlọpọ awọn ayẹwo ni akoko kanna.

Igbesẹ 3

PCR imudara

Nigbamii, gbe awo naa sinu ẹrọ PCR, eyiti o jẹ pataki cycler gbona.

RT-PCR akoko gidi ni a lo lati ṣe awari coronavirus aramada ti ọdun 2019 nipa imudara ọkọọkan ibi-afẹde ninu jiini RdrRP, E jiini ati jiini N.Yiyan jiini ibi-afẹde da lori alakoko ati ọkọọkan iwadii.

Igbesẹ akọkọ ti RT-PCR jẹ iyipada iyipada.Okun akọkọ ti DNA ibaramu jẹ iṣelọpọ, eyiti o bẹrẹ nipasẹ alakoko yiyipada PCR, eyiti o sopọ mọ apakan ibaramu ti jiini RNA gbogun ti.Lẹhinna yiyipada transcriptase ṣe afikun awọn nucleotides DNA si 3'ipari alakoko lati ṣajọpọ DNA ti o ni ibamu si RNA gbogun ti.Iwọn otutu ati iye akoko igbesẹ yii dale lori awọn alakoko, RNA ibi-afẹde, ati yiyipada transcriptase ti a lo.

Nigbamii ti, igbesẹ denaturation akọkọ ti wa ni lilo, eyiti o yọrisi denaturation ti arabara RNA-DNA.Igbesẹ yii jẹ pataki lati mu DNA polymerase ṣiṣẹ.Ni akoko kanna, yiyipada transcriptase jẹ aṣiṣẹ.

PCR oriširiši kan lẹsẹsẹ ti gbona iyika.Yiyipo kọọkan ni denaturation, annealing ati awọn igbesẹ itẹsiwaju.

Igbesẹ denaturation jẹ pẹlu igbona iyẹwu ifaseyin si iwọn 95 Celsius ati lilo rẹ fun denaturation ti awoṣe DNA oni-meji.

Ni igbesẹ ti nbọ, iwọn otutu ifasẹyin ti dinku si iwọn 58 Celsius, gbigba alakoko siwaju lati fikun si apakan ibaramu ti awoṣe DNA ti o ni okun ẹyọkan.Iwọn otutu annealing taara da lori gigun ati akopọ ti alakoko.

Ni igbesẹ itẹsiwaju, DNA polymerase ṣajọpọ okun DNA tuntun ti o jẹ ibamu si okun awoṣe DNA.Nipa fifi afikun awọn ekuro ọfẹ si awoṣe ni itọsọna 5'to 3' lati adalu esi.Iwọn otutu ti igbesẹ yii da lori DNA polymerase ti a lo.

Lẹhin iyipo akọkọ, ibi-afẹde DNA ti o ni ilopo meji ni a gba.

Lẹhinna, tẹ iyipo keji sii.DNA ti o ni okun-meji ti wa ni denatured lati ṣe agbejade awọn moleku DNA oni-okun meji.

Ni igbesẹ ti nbọ, iwọn otutu ifasẹyin ti dinku, awọn alakoko ti wa ni ifikun si awoṣe DNA ti o ni okun-ọkan kọọkan, ati pe iwadii Taq-eniyan ti wa ni ifikun si apakan ibaramu ti DNA ibi-afẹde.

Iwadii TaqMan ni fluorophore kan ti o ni ibatan si 5'ipari ti iwadii oligonucleotide.Nigba ti o ba ni itara nipasẹ orisun ina ti cycler, fluorophore njade fluorescence.Ni afikun, awọn ibere ti wa ni kq ti a quencher ni 3'opin.Isunmọ ti jiini onirohin si quencher ṣe idilọwọ wiwa ti fluorescence.

Ni igbesẹ itẹsiwaju, DNA polymerase ṣe akojọpọ okun tuntun kan.Nigbati polymerase ba de iwadii TaqMan, iṣẹ ṣiṣe 5′nuclease ailopin rẹ ya iwadii naa, yiya sọtọ awọ kuro ninu apanirun.

Pẹlu ọmọ kọọkan ti PCR, awọn ohun elo awọ diẹ sii ti wa ni idasilẹ, ti o yorisi ilosoke ninu kikankikan fluorescence ni ibamu si nọmba awọn amplicons ti a ṣepọ.

Ọna yii ngbanilaaye lati ṣe iṣiro nọmba ti ọkọọkan ti a fun ti o wa ninu apẹẹrẹ.Nọmba awọn ajẹkù DNA ti o ni ilọpo meji ni ilọpo meji ni iyipo kọọkan.Nitorina, PCR le ṣee lo lati ṣe itupalẹ awọn ayẹwo kekere pupọ.

Fun wiwọn ifihan agbara Fuluorisenti, atupa tungsten halogen, àlẹmọ ayọ, reflector, lẹnsi, àlẹmọ itujade ati idiyele pọmọ ẹrọ-lilo kamẹra CCD.

Igbesẹ 4 Wa

Fun wiwọn ifihan agbara Fuluorisenti, atupa tungsten halogen, àlẹmọ ayọ, reflector, lẹnsi, àlẹmọ itujade ati idiyele pọmọ ẹrọ-lilo kamẹra CCD.

Imọlẹ filtered lati inu atupa naa jẹ afihan nipasẹ olufihan, o kọja nipasẹ lẹnsi condenser, o si wa ni idojukọ si aarin iho kọọkan.Lẹhinna itanna ti o jade lati iho naa yoo han lati inu digi, o kọja nipasẹ àlẹmọ itujade, ati pe kamẹra CCD rii.Ni kọọkan PCR ọmọ, awọn ara-yiya fluorophore ina le ṣee wa-ri nipasẹ awọn CCD.

O ṣe iyipada ina ti o gba sinu data oni-nọmba.Ọna yii ni a pe ni PCR akoko gidi, ati pe o ngbanilaaye ibojuwo akoko gidi ti ilọsiwaju ti iṣe PCR.