• facebook
  • ti sopọ mọ
  • youtube

Akopọ

Idanimọ iyara ti awọn irugbin transgenic

Ọrọ / Tong Yucheng

Esiperimenta isẹ / Han Ying

Olootu / Wen Youjun

Awọn ọrọ / 1600+

Aba kika akoko / 8-10 iṣẹju

Idanimọ iyara ti awọn irugbin transgenic

Gẹgẹbi tuntun tuntun ninu yàrá-yàrá, kii ṣe iṣẹ ti o dara lati ṣe ayẹwo awọn ohun ọgbin rere lati inu opo awọn irugbin pẹlu iwọn iyipada kekere.Ni akọkọ, DNA gbọdọ jẹ jade lati nọmba nla ti awọn ayẹwo ni ọkọọkan, lẹhinna PCR yoo rii awọn jiini ajeji.Bibẹẹkọ, awọn abajade nigbagbogbo jẹ awọn ofo ati awọn ẹgbẹ pẹlu awọn nkan diẹ lẹẹkọọkan, ṣugbọn ko ṣee ṣe lati pinnu boya awọn wiwa ti o padanu tabi wiwa eke..Ṣe o jẹ alaini iranlọwọ pupọ lati koju iru ilana idanwo ati awọn abajade bi?Maṣe yọ ara rẹ lẹnu, arakunrin kọ ọ bi o ṣe le ṣe iboju jade awọn irugbin rere transgenic ni irọrun ati deede.

Igbesẹ 1: Awọn alakoko wiwa oniru

6.9-1

Ṣe ipinnu apilẹṣẹ apilẹṣẹ ati jiini exogenous lati rii ni ibamu si apẹẹrẹ lati ṣe idanwo, ki o yan aṣoju 100-500bp kan ni ọna pupọ fun apẹrẹ alakoko.Awọn alakoko to dara le rii daju pe deede ti awọn abajade wiwa ati ki o kuru akoko wiwa (wo àfikún fun awọn alakoko wiwa ti a lo nigbagbogbo).

Akiyesi:

Awọn alakoko ti a ṣe apẹrẹ tuntun nilo lati mu awọn ipo ifaseyin pọ si ati rii daju pe deede, konge, ati opin wiwa ti iṣawari ṣaaju ṣiṣe wiwa titobi nla.

Igbesẹ 2:Se agbekale esiperimenta bèèrè

6.9-2

Iṣakoso to dara: Lo DNA ti a sọ di mimọ ti o ni ajẹku ibi-afẹde bi awoṣe lati pinnu boya eto ifaseyin PCR ati awọn ipo jẹ deede.

Iṣakoso odi/ofo: Lo awoṣe DNA tabi ddH2Eyin ko ni ajẹkù ibi-afẹde ninu bi awoṣe lati rii boya orisun ibajẹ wa ninu eto PCR.

Itọkasi itọkasi inu: lo alakoko/apapọ iwadii ti jiini endogenous ti ayẹwo lati ṣe idanwo lati ṣe iṣiro boya awoṣe le ṣee wa-ri nipasẹ PCR.

Akiyesi:

Awọn iṣakoso ti o dara, odi / ofo ati awọn iṣakoso iṣakoso inu yẹ ki o ṣeto fun idanwo kọọkan lati ṣe iṣiro idiyele ti awọn abajade esiperimenta.

Igbesẹ 3: Igbaradi idanwo

6.9-3

Ṣaaju lilo, ṣe akiyesi boya ojutu naa ti dapọ paapaa.Ti o ba rii ojoriro, o nilo lati tuka ati dapọ ni ibamu si awọn ilana ṣaaju lilo.2×PCR illa nilo lati wa ni pipetted ati ki o dapọ leralera pẹlu kan micropipette ṣaaju lilo lati yago fun uneven ion pinpin.

Akiyesi:

Mu awọn ilana naa jade ki o ka wọn ni pẹkipẹki, ati ṣe awọn igbaradi ṣaaju idanwo ni ibamu pẹlu awọn ilana naa.

Igbesẹ 4: Mura eto ifaseyin PCR

6.9-4

Gẹgẹbi ilana ilana idanwo, dapọ awọn alakoko, H2O, 2× PCR illa, centrifuge ati pinpin wọn si ọpọn ifaseyin kọọkan.

Akiyesi:

Fun idanwo iwọn-nla tabi igba pipẹ, a gba ọ niyanju lati lo eto ifasilẹ PCR ti o ni enzymu UNG, eyiti o le yago fun idoti aerosol ti o fa nipasẹ awọn ọja PCR.

Igbesẹ 5: Ṣafikun awoṣe esi

6.9-5

Lilo imọ-ẹrọ PCR Taara, ko si iwulo fun ilana isọdọmọ acid nucleic ti o nira.Awoṣe apẹẹrẹ le ṣe imurasilẹ laarin awọn iṣẹju 10 ati ṣafikun si eto ifa PCR ti o baamu.

Akiyesi:

Ọna Lysis ni ipa wiwa to dara julọ, ati pe ọja ti o gba le ṣee lo fun awọn aati wiwa lọpọlọpọ.

6.9-6

5.1: PCR taara ti awọn leaves

Ni ibamu si awọn iwọn ti awọn aworan ninu awọn Afowoyi, ge awọn tissu bunkun pẹlu iwọn ila opin ti 2-3mm ati ki o gbe sinu PCR lenu eto.

Akiyesi: Rii daju pe awọn ajẹkù ewe ti wa ni immersed patapata ni ojutu esi esi PCR, ati pe maṣe ṣafikun àsopọ ewe ti o pọ ju.

5.2: bunkun lysis ọna

Ge àsopọ ewe pẹlu iwọn ila opin ti 5-7mm ki o si gbe sinu tube centrifuge kan.Ti o ba yan awọn ewe ti o dagba, jọwọ yago fun lilo awọn iṣan ti iṣan akọkọ ti ewe naa.Pipette 50ul Buffer P1 lysate sinu tube centrifuge lati rii daju pe lysate le fi omi ṣan awọ ewe naa patapata, gbe e sinu cycler gbona tabi iwẹ irin, ati lyse ni 95 ° C fun awọn iṣẹju 5-10.

6.9-7
6.9-8

Ṣafikun 50ul Buffer P2 ojutu neutralization ati dapọ daradara.Abajade lysate le ṣee lo bi awoṣe kan ati ṣafikun si eto ifaseyin PCR.

Akiyesi: Iwọn awoṣe yẹ ki o wa laarin 5-10% ti eto PCR, ati pe ko yẹ ki o kọja 20% (fun apẹẹrẹ, ninu eto PCR 20μl, ṣafikun 1-2μl ti ifipamọ lysis, kii ṣe ju 4μl).

Igbesẹ 6: Idahun PCR

6.9-9

Lẹhin ti centrifuging awọn PCR lenu tube, gbe wọn ni a PCR irinse fun amúṣantóbi ti.

Akiyesi:

Idahun naa nlo awoṣe ti kii ṣe mimọ fun imudara, nitorinaa nọmba awọn iyipo imudara jẹ awọn iyipo 5-10 diẹ sii ju nigba lilo awoṣe DNA mimọ.

Igbesẹ 7: Wiwa Electrophoresis ati itupalẹ abajade

6.9-10
6.9-11

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Ọna DNA ti a sọ di mimọ

2 \ 5: Taara PCR ọna

3\6: Iṣakoso ofo

Iṣakoso Didara:

Awọn abajade idanwo ti awọn iṣakoso oriṣiriṣi ti a ṣeto sinu idanwo yẹ ki o pade awọn ipo wọnyi.Bibẹẹkọ, o yẹ ki a ṣe itupalẹ idi ti iṣoro naa, ati pe idanwo naa yẹ ki o tun ṣe lẹhin ti iṣoro naa ti yọkuro.

Table 1. Awọn abajade idanwo deede ti awọn ẹgbẹ iṣakoso orisirisi

6.9-12

* Nigbati a ba lo plasmid bi iṣakoso rere, abajade idanwo jiini endogenous le jẹ odi

Idajọ abajade:

A. Abajade idanwo ti jiini endogenous ti ayẹwo jẹ odi, ti o nfihan pe DNA ti o yẹ fun wiwa PCR lasan ko le ṣe jade lati inu apẹẹrẹ tabi DNA ti a fa jade ni awọn inhibitors ifa PCR, ati pe o yẹ ki DNA fa jade lẹẹkansi.

B. Abajade idanwo ti jiini endogenous ti ayẹwo jẹ rere, ati abajade idanwo ti jiini exogenous jẹ odi, ti o fihan pe DNA ti o yẹ fun wiwa PCR lasan ni a yọ jade lati inu apẹẹrẹ, ati pe a le ṣe idajọ pe a ko rii Jiini XXX ninu apẹẹrẹ.

C. Abajade idanwo ti jiini endogenous ti ayẹwo jẹ rere, ati abajade idanwo ti jiini exogenous jẹ rere, ti o fihan pe DNA ti o yẹ fun wiwa PCR lasan ni a ti yọ jade lati inu apẹẹrẹ, ati pe DNA ti o wa ninu apilẹṣẹ XXX ni ninu.Awọn idanwo idaniloju le ṣee ṣe siwaju sii.

Igbesẹ 8: Awọn alakoko wiwa apẹrẹ

 

6.9-13

Lẹhin idanwo naa, lo 2% iṣuu soda hypochlorite ojutu ati ojutu ethanol 70% lati nu agbegbe idanwo lati ṣe idiwọ idoti ayika.

Àfikún

Tabili 2. Awọn alakoko ti o wọpọ fun wiwa PCR gbogbogbo ti awọn ohun ọgbin ti a ṣe atunṣe

6.9-14

Iwe itọkasi:

SN/T 1202-2010, Dije PCR erin ọna fun atilẹba ohun kan títúnṣe ọgbin eroja ni ounje.

Ikede Ile-iṣẹ ti Iṣẹ-ogbin 1485-5-2010, Idanwo awọn ohun elo ti awọn ohun ọgbin ti a yipada nipa jiini ati awọn ọja wọn-iresi M12 ati awọn itọsẹ rẹ.


Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹta-09-2021