• PCR jẹ ọna ti a lo lati mu DNA pọ si lati iwọn kekere ti awoṣe DNA.RT-PCR nlo transcription yiyipada lati ṣe agbejade awoṣe DNA lati orisun RNA kan ti o le jẹ ki o pọ si.
• PCR ati RT-PCR jẹ awọn aati ipari ni igbagbogbo, lakoko ti qPCR ati RT-qPCR lo awọn kainetik ti oṣuwọn ti iṣelọpọ ọja lakoko iṣesi PCR lati ṣe iwọn iye awoṣe ti o wa.
• Awọn ọna tuntun, gẹgẹbi PCR oni-nọmba, pese iwọn pipe ti awoṣe DNA akọkọ, lakoko ti awọn ọna bii PCR isothermal dinku iwulo fun ohun elo gbowolori lati pese awọn abajade igbẹkẹle.

Iṣesi pq polymerase (PCR) jẹ irọrun ti o rọrun ati ilana ilana isedale molikula ti a lo pupọ lati pọ si ati ṣawari awọn ilana DNA ati RNA.Ti a ṣe afiwe si awọn ọna ibile ti ẹda oniye DNA ati imudara, eyiti o le gba awọn ọjọ nigbagbogbo, PCR nilo awọn wakati diẹ nikan.PCR jẹ ifarabalẹ pupọ ati pe o nilo awoṣe iwonba fun wiwa ati imudara awọn ilana kan pato.Awọn ọna PCR ipilẹ ti ni ilọsiwaju siwaju lati inu DNA ti o rọrun ati wiwa RNA.Ni isalẹ, a ti pese awotẹlẹ ti awọn oriṣiriṣi awọn ọna PCR ati awọn reagents ti a pese ni Enzo Life Sciences fun awọn ibeere iwadii rẹ.A ṣe ifọkansi lati ṣe iranlọwọ fun awọn onimo ijinlẹ sayensi ni iyara lati wọle si awọn reagents PCR lati lo ninu iṣẹ ṣiṣe iwadii atẹle wọn!

PCR

Fun PCR boṣewa, gbogbo ohun ti o nilo ni DNA polymerase, iṣuu magnẹsia, awọn nucleotides, awọn alakoko, awoṣe DNA lati jẹ imudara, ati thermocycler kan.Ilana PCR jẹ rọrun bi idi rẹ: 1) DNA ti o ni ilọpo meji (dsDNA) ti wa ni idaabobo ooru, 2) awọn alakoko ṣe deede si awọn okun DNA ẹyọkan, ati 3) awọn alakoko jẹ gbooro nipasẹ DNA polymerase, ti o mu ki awọn ẹda meji ti okun DNA atilẹba.Awọn denaturation, annealing, ati elongation ilana lori kan lẹsẹsẹ ti awọn iwọn otutu ati awọn akoko ti wa ni mo bi ọkan ọmọ ti ampilifaya (Fig. 1).

Igbesẹ kọọkan ti ọmọ yẹ ki o wa ni iṣapeye fun awoṣe ati ipilẹ alakoko ti a lo.Yi ọmọ ti wa ni tun to 20-40 igba, ati awọn ampilifaya ọja le ki o si wa ni atupale, ojo melo nipa agarose jeli (Fig. 2).

Bii PCR jẹ ọna ifura pupọ ati pe awọn iwọn kekere pupọ nilo fun awọn aati ẹyọkan, igbaradi ti apopọ titunto si fun awọn aati pupọ ni a ṣeduro.Ijọpọ titunto si gbọdọ jẹ idapọ daradara ati lẹhinna pin nipasẹ nọmba awọn aati, ni idaniloju pe iṣesi kọọkan yoo ni iye kanna ti henensiamu, dNTPs, ati awọn alakoko.Ọpọlọpọ awọn olupese, gẹgẹbi Enzo Life Sciences, tun pese awọn apopọ PCR ti o ni ohun gbogbo tẹlẹ ayafi awọn alakoko ati awoṣe DNA.

Guanine/Cytosine-ọlọrọ (GC-ọlọrọ) awọn agbegbe ṣe aṣoju ipenija ni awọn ilana PCR boṣewa.Awọn ilana-ọlọrọ GC jẹ iduroṣinṣin diẹ sii ju awọn atẹle pẹlu akoonu GC kekere.Pẹlupẹlu, awọn ilana GC-ọlọrọ ṣọ lati dagba awọn ẹya ile-atẹle, gẹgẹbi awọn losiwajulosehin irun.Bi abajade, GC-ọlọrọ awọn okun onimeji ni o nira lati yapa patapata lakoko ipele denaturation.Nitoribẹẹ, DNA polymerase ko le ṣepọ okun tuntun laisi idiwọ.Iwọn otutu denaturation ti o ga julọ le mu eyi dara si, ati awọn atunṣe si iwọn otutu annealing ti o ga julọ ati akoko annealing kukuru le ṣe idiwọ isọdọkan ti ko ni pato ti awọn alakoko ọlọrọ GC.Afikun reagents le mu awọn ampilifaya ti GC-ọlọrọ lesese.DMSO, glycerol, ati betaine ṣe iranlọwọ lati dabaru awọn ẹya ile-keji ti o fa nipasẹ awọn ibaraenisepo GC ati nitorinaa dẹrọ iyapa ti awọn okun meji.

Gbona Bẹrẹ PCR

Imudara ti ko ni pato jẹ iṣoro ti o le waye lakoko PCR.Pupọ julọ awọn polymerases DNA ti a lo fun PCR ṣiṣẹ dara julọ ni awọn iwọn otutu ni ayika 68°C si 72°C.Enzymu le, sibẹsibẹ, tun ṣiṣẹ ni awọn iwọn otutu kekere, botilẹjẹpe si iwọn kekere.Ni awọn iwọn otutu ti o wa ni isalẹ iwọn otutu annealing, awọn alakoko le di ti kii ṣe ni pato ati ki o yorisi imudara ti kii ṣe pato, paapaa ti a ba ṣeto iṣesi lori yinyin.Eyi le ṣe idiwọ nipasẹ lilo awọn inhibitors polymerase ti o yapa kuro ninu polymerase DNA ni kete ti iwọn otutu kan ba de, nitorinaa ọrọ PCR bẹrẹ gbona.Inhibitor le jẹ apakokoro ti o so polymerase ati awọn denatures ni iwọn otutu denaturation ibẹrẹ (95°C ni igbagbogbo).

Ga Fidelity Polymerase

Lakoko ti awọn polymerases DNA n pọ si ni deede si ọna awoṣe atilẹba, awọn aṣiṣe ni ibaramu nucleotide le waye.Awọn aiṣedeede ninu awọn ohun elo bii cloning le ja si awọn iwe afọwọkọ gedu, ati itumọ aiṣedeede tabi awọn ọlọjẹ ti ko ṣiṣẹ ni isalẹ.Lati yago fun awọn aiṣedeede wọnyi, awọn polymerases pẹlu iṣẹ ṣiṣe “atunṣe” ti jẹ idanimọ ati dapọ si ṣiṣan iṣẹ.Polymerase iṣatunṣe akọkọ, Pfu, jẹ idanimọ ni ọdun 1991 ni Pyrococcus furiosus.Enzymu Pfu yii ni iṣẹ exonuclease 3' si 5'.Bi DNA ti n pọ si, exonuclease yọkuro awọn nucleotides ti ko baamu ni opin 3' ti okun naa.Nucleotide ti o pe yoo wa ni rọpo lẹhinna, ati pe iṣelọpọ DNA tẹsiwaju.Idanimọ ti awọn ilana nucleotide ti ko tọ da lori isunmọ abuda fun triphosphate nucleoside ti o tọ pẹlu henensiamu, nibiti aisedeede abuda fa fifalẹ iṣelọpọ ati gba fun rirọpo to pe.Iṣẹ ṣiṣe atunṣe ti Pfu polymerase ṣe abajade ni awọn aṣiṣe diẹ ni ọna ti o kẹhin ni akawe si Taq DNA polymerase.Ni awọn ọdun aipẹ, a ti ṣe idanimọ awọn ensaemusi atunṣe atunṣe miiran, ati awọn iyipada ti enzymu Pfu atilẹba ti a ti ṣe lati dinku oṣuwọn aṣiṣe diẹ sii lakoko imudara DNA.

RT-PCR

PCR transcription yiyipada, tabi RT-PCR, ngbanilaaye lilo RNA bi awoṣe.Igbesẹ afikun ngbanilaaye wiwa ati imudara RNA.RNA yi pada si kikọ DNA ti o ni ibamu (cDNA), ni lilo yiyipada transcriptase.Didara ati mimọ ti awoṣe RNA jẹ pataki fun aṣeyọri ti RT-PCR.Igbesẹ akọkọ ti RT-PCR ni iṣelọpọ ti arabara DNA/RNA kan.Iyipada transcriptase tun ni iṣẹ RNase H kan, eyiti o dinku apakan RNA ti arabara naa.Molikula DNA ti o ni okun kan jẹ lẹhinna pari nipasẹ iṣẹ ṣiṣe DNA ti o gbẹkẹle DNA ti transscriptase yiyipada sinu cDNA.Imudara ti iṣesi okun-akọkọ le ni ipa ilana imudara.Lati ibi yii lọ, ilana PCR boṣewa ni a lo lati mu cDNA pọ si.O ṣeeṣe lati yi RNA pada si cDNA nipasẹ RT-PCR ni ọpọlọpọ awọn anfani, ati pe o jẹ lilo akọkọ fun itupalẹ ikosile pupọ.RNA jẹ ẹyọkan ati riru pupọ, eyiti o jẹ ki o nira lati ṣiṣẹ pẹlu.O ṣe deede bi igbesẹ akọkọ ni qPCR, eyiti o ṣe iwọn awọn iwe afọwọkọ RNA ni apẹẹrẹ ti ibi.

qPCR ati RT-qPCR

PCR pipo (qPCR) ni a lo lati ṣawari, ṣe apejuwe ati ṣe iwọn awọn acids nucleic fun awọn ohun elo lọpọlọpọ.Ninu RT-qPCR, awọn iwe afọwọkọ RNA nigbagbogbo ni iwọn nipasẹ yiyipada wọn si cDNA ni akọkọ, bi a ti ṣalaye loke, ati lẹhinna qPCR ni a ṣe ni atẹle.Gẹgẹbi PCR boṣewa, DNA ti ni ilọsiwaju nipasẹ awọn igbesẹ atunwi mẹta: denaturation, annealing, ati elongation.Bibẹẹkọ, ni qPCR, isamisi fluorescent ngbanilaaye ikojọpọ data bi PCR ti nlọsiwaju.Ilana yii ni ọpọlọpọ awọn anfani nitori ọpọlọpọ awọn ọna ati awọn kemistri ti o wa.

Ni qPCR ti o da-awọ (eyiti o jẹ alawọ ewe), isamisi fluorescent ngbanilaaye titobi ti awọn ohun elo DNA ti o ni imudara nipa lilo lilo awọ dipọ dsDNA.Lakoko iyipo kọọkan, a ṣe iwọn fluorescence.Ifihan agbara fluorescence pọ si ni iwọn si iye DNA ti a ṣe atunṣe.Nitorinaa, DNA ti wa ni iwọn ni “akoko gidi” (Fig. 3).Awọn aila-nfani si qPCR ti o da lori ni pe ibi-afẹde kan ṣoṣo ni a le ṣe ayẹwo ni akoko kan ati pe awọ naa yoo sopọ mọ eyikeyi ds-DNA ti o wa ninu apẹẹrẹ.

Ni qPCR ti o da lori iwadii, ọpọlọpọ awọn ibi-afẹde ni a le rii nigbakanna ni ayẹwo kọọkan, ṣugbọn eyi nilo iṣapeye ati apẹrẹ ti iwadii (s) kan pato-afẹde ti a lo ni afikun si awọn alakoko.Orisirisi awọn aṣa aṣawakiri wa, ṣugbọn iru ti o wọpọ julọ jẹ iwadii hydrolysis, eyiti o ṣafikun fluorophore ati quencher.Fluorescence resonance agbara gbigbe (FRET) idilọwọ awọn itujade ti fluorophore nipasẹ awọn quencher nigba ti ibere wa ni mule.Bibẹẹkọ, lakoko iṣesi PCR, iwadii naa jẹ hydrolyzed lakoko itẹsiwaju alakoko ati imudara ti ọkọọkan kan pato ti o dè.Pipin ti iwadii naa yapa fluorophore kuro ninu quencher ati awọn abajade ni ilosoke ti o gbẹkẹle imudara ni fluorescence (Fig. 4).Nitorinaa, ifihan agbara fluorescence lati iṣesi qPCR ti o da lori iwadii jẹ ibamu si iye ti ọkọọkan ibi-afẹde iwadii ti o wa ninu apẹẹrẹ.Nitori qPCR ti o da lori iwadii jẹ pato diẹ sii ju qPCR ti o da lori dai, o jẹ igbagbogbo imọ-ẹrọ ti a lo ninu awọn igbelewọn iwadii orisun-qPCR.

Imudara Isothermal

PCR ti a mẹnuba loke awọn ilana nilo ohun elo igbona-ona ti o gbowolori lati gbe ni deede soke ati isalẹ awọn iwọn otutu iyẹwu fun denaturation, annealing, ati awọn igbesẹ itẹsiwaju.Ọpọlọpọ awọn ilana ti ni idagbasoke ti ko nilo iru awọn ẹrọ to peye ati pe a le ṣe ni iwẹ omi ti o rọrun tabi paapaa laarin awọn sẹẹli ti iwulo.Awọn imuposi wọnyi ni a pe lapapọ isothermal ampilifaya ati iṣẹ ti o da lori iwọn, laini, tabi ampilifaya kasikedi.

Iru ampilifaya isothermal ti o mọ julọ julọ jẹ ampilifaya isothermal mediated lupu, tabi LAMP.LAMP nlo imudara alapin ni 65⁰C lati mu DNA tabi RNA ti awoṣe pọ si.Nigbati o ba n ṣe LAMP, awọn alakoko mẹrin si mẹfa ti o ni ibamu si awọn agbegbe ti DNA afojusun ni a lo pẹlu DNA polymerase lati ṣepọ DNA tuntun.Meji ninu awọn alakoko wọnyi ni awọn ilana itọrẹ ti o ṣe idanimọ awọn itọsẹ ninu awọn alakoko miiran ti o si so wọn pọ, ngbanilaaye fun eto “lupu” kan lati dagba ninu DNA tuntun ti o ṣajọpọ ti lẹhinna ṣe iranlọwọ fun mimu alakoko ni awọn iyipo ti imudara ti o tẹle.ATUTU le jẹ wiwo nipasẹ awọn ọna pupọ, pẹlu fluorescence, agarose gel electrophoresis, tabi colorimetry.Irọrun ti wiwo ati wiwa wiwa tabi isansa ọja nipasẹ colorimetry ati aini ohun elo gbowolori ti o nilo jẹ ki LAMP jẹ aṣayan ti o dara fun idanwo SARS-CoV-2 ni awọn agbegbe nibiti idanwo lab ile-iwosan ko wa ni imurasilẹ, tabi ibi ipamọ ati gbigbe awọn ayẹwo ko ṣee ṣe, tabi ni awọn laabu ti ko ni tẹlẹ ni ẹrọ itanna thermocycling PCR.