Ipilẹ apẹrẹ akọkọ (99% awọn iṣoro le ṣee yanju)
1. Gigun alakoko: Iwe-ẹkọ naa nilo 15-30bp, nigbagbogbo nipa 20bp.Ipo gangan dara julọ lati jẹ 18-24bp lati rii daju pe pato, ṣugbọn gun to dara julọ, alakoko pipẹ yoo tun dinku iyasọtọ, ati dinku ikore.
2. Akoko imudara alakoko: 200-500bp yẹ, ati pe ajẹku le faagun si 10kb labẹ awọn ipo pataki.
3. Ipilẹ alakoko: Awọn akoonu ti G + C yẹ ki o jẹ 40-60%, G + C ti o pọju ipa ti o pọju ko dara, G + C pupọ jẹ rọrun lati han awọn ẹgbẹ ti kii ṣe pato.ATGC dara julọ pinpin laileto, yago fun awọn iṣupọ ti diẹ ẹ sii ju 5 purine tabi pyrimidine nucleotides.Multi-gc fun ipari 5 ′ ati awọn ilana agbedemeji lati mu iduroṣinṣin pọ si, yago fun GC ọlọrọ ni ipari 3′, ko si GC fun awọn ipilẹ 3 kẹhin, tabi ko si GC fun 3 ti awọn ipilẹ 5 kẹhin.
4. Yago fun eto ile-ẹkọ keji ni awọn alakoko, ki o yago fun ibaramu laarin awọn alakoko meji, paapaa pipe ni opin 3, bibẹẹkọ dimer alakoko yoo ṣẹda ati awọn ẹgbẹ imudara ti kii ṣe pato yoo jẹ ipilẹṣẹ.
5. Awọn ipilẹ ti o wa ni 3 'opin awọn alakoko, paapaa awọn ipilẹ ti o kẹhin ati penultimate, yẹ ki o wa ni asopọ ti o muna lati yago fun ikuna PCR nitori awọn ipilẹ ebute ti ko ni asopọ.
6. Awọn alakoko ni tabi o le fi kun pẹlu awọn aaye fifọ ti o yẹ, ati pe ọna ifọkansi ti o pọ si yẹ ki o ni awọn aaye ti o yẹ ti o yẹ, eyiti o jẹ anfani pupọ fun itupalẹ cleavage tabi cloning molikula.
7. Ni pato ti awọn alakoko: awọn alakoko ko yẹ ki o ni homology ti o han gbangba pẹlu awọn ilana miiran ni ibi ipamọ data itọsẹ acid nucleic.
8. Kọ ẹkọ lati lo sọfitiwia: PP5, Oligo6, DNAstar, Vector NTI, primer3 (Apẹrẹ ori ayelujara yii ṣiṣẹ dara julọ).
Awọn akoonu ti o wa loke le yanju o kere ju 99% ti awọn iṣoro apẹrẹ alakoko.
Ṣakoso awọn alaye ti apẹrẹ alakoko
1. Alakoko ipari
Gigun alakoko gbogbogbo jẹ awọn ipilẹ 18 ~ 30.Ni gbogbogbo, ifosiwewe pataki julọ ti npinnu iwọn otutu annealing ti alakoko jẹ ipari ti alakoko.Iwọn otutu mimu ti alakoko ni gbogbogbo ti yan (iye Tm -5℃), ati diẹ ninu lo iye Tm taara.Awọn agbekalẹ wọnyi le ṣee lo lati ṣe iṣiro iwọn otutu annealing ti awọn alakoko.
Nigbati ipari alakoko ba kere ju 20bp: [4(G+C)+2(A+T)]-5℃
Nigbati ipari alakoko ba tobi ju 20bp: 62.3℃+0.41℃(%GC) -500/ipari-5℃
Ni afikun, ọpọlọpọ sọfitiwia tun le ṣee lo lati ṣe iṣiro iwọn otutu annealing, ilana iṣiro yoo yatọ, nitorinaa nigbami iye iṣiro le ni aafo kekere kan.Lati mu awọn aati PCR pọ si, awọn alakoko ti o kuru ju ti o rii daju pe awọn iwọn otutu annealing ti ko kere ju 54℃ ni a lo fun ṣiṣe to dara julọ ati pato.
Lapapọ, iyasọtọ alakoko n pọ si nipasẹ ipin mẹrin fun afikun nucleotide kọọkan, nitorinaa gigun alakoko to kere julọ fun awọn ohun elo pupọ jẹ 18 nucleotides.Iwọn oke ti ipari alakoko ko ṣe pataki pupọ, ni pataki ni ibatan si ṣiṣe iṣe iṣe.Nitori entropy, akoko alakoko to gun, iwọn kekere ti o dinku lati sopọ mọ DNA ibi-afẹde lati ṣe apẹrẹ ti o duro ni ilopo meji fun polymerase DNA lati dipọ.
Nigbati o ba nlo sọfitiwia lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko, ipari awọn alakoko le jẹ ipinnu nipasẹ iye TM ni titan, paapaa fun awọn alakoko ti pipo fluorescence PCR, TM=60℃ tabi bẹ yẹ ki o ṣakoso.
2.GC akoonu
Ni gbogbogbo, akoonu ti G+C ni awọn ilana alakoko jẹ 40% ~ 60%, ati akoonu GC ati iye Tm ti bata ti alakoko yẹ ki o wa ni iṣọkan.Ti alakoko ba ni ifarahan GC to ṣe pataki tabi AT, iye ti o yẹ ti A, T tabi G ati iru C le ṣe afikun si 5 'opin ti alakoko.
3. Annealing otutu
Awọn iwọn otutu annealing yẹ ki o jẹ 5℃ kekere ju iwọn otutu ti a ko le lọ.Ti nọmba awọn ipilẹ alakoko ba kere, iwọn otutu annealing le pọ si ni deede, eyiti o le mu iyasọtọ PCR pọ si.Ti nọmba awọn ipilẹ ba tobi, iwọn otutu annealing le dinku ni deede.Iyatọ iwọn otutu annealing laarin bata ti awọn alakoko ti 4 ℃ ~ 6℃ kii yoo ni ipa lori ikore PCR, ṣugbọn apere ni iwọn otutu annealing ti bata ti awọn alakoko jẹ kanna, eyiti o le yatọ laarin 55℃ ~ 75℃.
4. Yago fun awọn Atẹle be agbegbe ti awọn ampilifaya awoṣe
O dara julọ lati yago fun agbegbe igbekalẹ Atẹle ti awoṣe nigbati o ba yan ajẹku imudara.Eto alatẹle iduroṣinṣin ti ajeku ibi-afẹde le jẹ asọtẹlẹ ati iṣiro nipasẹ sọfitiwia kọnputa ti o wulo, eyiti o ṣe iranlọwọ fun yiyan awoṣe.Awọn abajade idanwo fihan pe imugboroja nigbagbogbo ko ni aṣeyọri nigbati agbara ọfẹ (△G) ti agbegbe lati faagun kere ju 58.6lkJ/mol.
5. Ibamu pẹlu DNA afojusun
Nigbati ọkọọkan DNA ibi-afẹde ti o pọ si tobi, alakoko le sopọ si awọn ẹya pupọ ti DNA afojusun, ti o mu abajade awọn ẹgbẹ pupọ han ninu abajade.Ni akoko yii o jẹ dandan lati lo idanwo sọfitiwia BLAST, oju opo wẹẹbu:http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/.Yan Sopọ awọn ọna meji (bl2seq).
Lilọ awọn ilana alakoko si agbegbe 1 ati ibi-afẹde awọn ilana DNA si agbegbe 2 jẹ iyipada, ati BLAST ṣe iṣiro ibaramu, antisense, ati awọn iṣeeṣe miiran, nitorinaa awọn olumulo ko nilo lati ṣe akiyesi boya awọn ẹwọn mejeeji jẹ awọn ẹwọn oye.O tun le tẹ nọmba GI sii ti o ba mọ nọmba GI ti ọkọọkan ninu aaye data, nitorinaa o ko ni lati lẹẹmọ apakan nla ti ọkọọkan.Nikẹhin, tẹ Parapọ ni 3 lati rii boya alakoko ni awọn aaye isokan lọpọlọpọ ninu DNA afojusun.
6. Alakoko ebute
Ipari 3 ti alakoko ni ibiti itẹsiwaju bẹrẹ, nitorinaa o ṣe pataki lati yago fun awọn ibaamu lati bẹrẹ nibẹ.Ipari 3 ko yẹ ki o jẹ diẹ sii ju 3 ni itẹlera G tabi C, nitori eyi yoo fa ki alakoko fa aṣiṣe ni agbegbe ilana imudara G+C.Opin 3 ko le ṣe agbekalẹ eyikeyi igbekalẹ keji, ayafi ni pataki PCR (AS-PCR) awọn aati, 3′ opin alakoko ko le jẹ ibaamu.Fun apẹẹrẹ, ti agbegbe fifi ẹnọ kọ nkan ba pọ si, 3 'opin alakoko ko yẹ ki o fopin si ni ipo kẹta ti codon, nitori ipo kẹta ti codon jẹ itara si ibajẹ, eyiti yoo ni ipa lori pato ati imudara ti imudara.Nigbati o ba nlo awọn alakoko isọdọtun, tọka si tabili lilo codon, fiyesi si ayanfẹ ti ibi, maṣe lo awọn alakoko isọdọkan ni opin 3′, ati lo ifọkansi giga ti awọn alakoko (1uM-3uM).
7. Atẹle be ti alakoko
Awọn alakoko funrararẹ ko yẹ ki o ni awọn ilana ibaramu, bibẹẹkọ awọn alakoko funrararẹ yoo ṣe agbo sinu awọn ẹya irun, ati pe eto-atẹle yii yoo ni ipa lori abuda awọn alakoko ati awọn awoṣe nitori idiwọ steric.Ti a ba lo idajọ atọwọda, awọn ipilẹ ibaramu ti nlọ lọwọ ti awọn alakoko funrararẹ ko yẹ ki o tobi ju 3bp.Ko yẹ ki o jẹ ibaramu laarin awọn alakoko meji, ni pataki ifarapa ibaramu ti 3 'opin yẹ ki o yee lati yago fun dida awọn dimers alakoko.Ni gbogbogbo, ko yẹ ki o jẹ diẹ sii ju 4 awọn ipilẹ itẹlera isomọ tabi ibaramu laarin bata alakoko.
8. Fi awọn asami tabi loci
Ipari 5 naa ni ipa diẹ lori iyasọtọ imudara ati nitorinaa o le yipada laisi ni ipa ni pato imudara.Iyipada ti alakoko 5 'opin pẹlu: fifi aaye ihamọ enzymu kun;Aami biotin, fluorescence, digoxin, Eu3+, bbl Ṣe afihan awọn ilana DNA abuda amuaradagba;Ṣiṣafihan awọn aaye iyipada, fifi sii ati awọn ilana iyipada ti o padanu ati iṣafihan awọn ilana olupolowo, bbl Awọn ipilẹ afikun yoo ni ipa diẹ sii tabi kere si ni ipa ṣiṣe ti iṣamulo ati mu anfani ti ipilẹṣẹ dimer alakoko, ṣugbọn diẹ ninu awọn adehun gbọdọ ṣee ṣe fun igbesẹ atẹle.Awọn ilana afikun ti ko si lori ọkọọkan ibi-afẹde, gẹgẹbi awọn aaye ihamọ ati awọn ilana olupolowo, le ṣe afikun si 5′ ipari ti alakoko laisi ni ipa ni pato.Awọn ilana wọnyi ko si ninu iṣiro awọn iye Tm alakoko, ṣugbọn o yẹ ki o ni idanwo fun ibaramu ati igbekalẹ Atẹle inu.
9. Subclones
Pupọ julọ akoko naa, PCR jẹ oniye alakoko nikan, ati lẹhinna a nilo lati subclone ajẹkù ibi-afẹde sinu ọpọlọpọ awọn onijakidijagan, nitorinaa a nilo lati ṣe apẹrẹ awọn ipilẹ afikun fun iṣẹ atẹle ni igbesẹ PCR.
Diẹ ninu awọn ilana ti a ṣe apẹrẹ fun subcloning jẹ akopọ ni isalẹ.
Aaye hihamọ endonuclease ti wa ni afikun
Ṣafikun awọn aaye ihamọ enzymu jẹ ọna ti o wọpọ julọ ti a lo fun subcloning awọn ọja PCR.Ni gbogbogbo, aaye fifọ jẹ awọn ipilẹ mẹfa, ni afikun si 5 'opin ti aaye fifọ nilo lati ṣafikun awọn ipilẹ aabo 2 ~ 3.Sibẹsibẹ, nọmba awọn ipilẹ aabo ti o nilo nipasẹ awọn enzymu oriṣiriṣi yatọ.Fun apẹẹrẹ, SalⅠ ko nilo ipilẹ aabo, EcoRⅤ nilo ipilẹ aabo 1, KoⅠ nilo awọn ipilẹ aabo 2, ati Hind Ⅲ nilo awọn ipilẹ aabo 3.
LIC ṣe afikun iru
Orukọ kikun ti LIC jẹ cloning-ominira Ligation, ọna ti cloning ti Navogen ṣe pataki fun apakan rẹ ti fekito pET.Olupese pET ti a pese sile nipasẹ ọna LIC ni awọn opin okun alalepo 12-15 ti kii ṣe ibaramu, eyiti o ṣe ibamu awọn opin alalepo ti o baamu lori ajẹkù ifibọ ibi-afẹde.Fun awọn idi imudara, ilana alakoko 5′ ti ajẹkù ti a fi sii yẹ ki o ṣe ibamu si fekito LIC.Iṣẹ-ṣiṣe 3′→ 5′ extranect ti T4 DNA polymerase le ṣe agbekalẹ okun kan ṣoṣo ti o lele lori ajẹkù ti a fi sii lẹhin igba diẹ.Nitoripe ọja naa le ṣe agbekalẹ nikan lati annealing pelu owo ti ajẹkù ti a ti pese sile ati fekito, ọna yii yara pupọ ati lilo daradara, ati pe o jẹ didari ẹda oniye.
Dari TA oniye fi iru
TA cloning ko lagbara lati fojusi ajẹkù sinu fekito kan, nitorinaa nigbamii Invitrogen ṣe agbekalẹ fekito kan ti o le fojusi cloning, eyiti o ni ipilẹ olokiki mẹrin GTGGS ni opin kan.Nitorinaa, ninu apẹrẹ ti awọn alakoko PCR, awọn ilana ibaramu yẹ ki o ṣafikun ni ibamu, ki awọn ajẹkù le jẹ “iṣalaye”.
Ti o ba kuru ni akoko, o le gbiyanju isọdọkan taara, apapọ jiini pẹlu vector, eyiti a pe ni synthesis gene ET ni awọn onimọran.
D. Ni-Fusion ti ẹda oniye ọna
Ko si ligase beere, ko si gun lenu beere.Niwọn igba ti ọna kan ni awọn opin mejeeji ti awọn ifaworanhan laini ti a ṣe afihan Ni apẹrẹ ti awọn alakoko, lẹhinna ọja PCR ati pekito laini ti wa ni afikun sinu ojutu enzymu in-fusion ti o ni BSA ati gbe ni iwọn otutu yara fun idaji wakati kan, iyipada le ṣee ṣe.Ọna yii dara julọ fun iyipada iwọn didun nla.
10. Dapọ alakoko
Nigba miiran, alaye ti o lopin nikan ni a mọ nipa apẹrẹ alakoko.Fun apẹẹrẹ, ti ọna amino acid nikan ni a mọ, alakoko ti o dapọ le jẹ apẹrẹ.Alakoko ti o dapọ jẹ adalu awọn ilana oriṣiriṣi ti o nsoju gbogbo awọn aye ipilẹ ti o yatọ ti o fi koodu amino acid kan pamọ.Lati mu iyasọtọ pọ si, o le tọka si tabili lilo codon lati dinku isọdọkan ni ibamu si awọn yiyan lilo ipilẹ ti awọn oriṣiriṣi oganisimu.Hypoxanthine le ṣe pọ pẹlu gbogbo awọn ipilẹ lati dinku iwọn otutu annealing ti alakoko.Ma ṣe lo awọn ipilẹ ti a somọ ni 3 ′ opin alakoko nitori annealing ti awọn ipilẹ 3 ti o kẹhin ni opin 3′ ti to lati pilẹṣẹ PCR ni aaye ti ko tọ.Awọn ifọkansi alakoko ti o ga julọ (1μM si 3μM) ni a lo nitori awọn alakoko ni ọpọlọpọ awọn akojọpọ isọdọkan kii ṣe pato si awoṣe ibi-afẹde.
PCR aise ohun eloiṣakoso
1. alakoko opoiye
Ifojusi ti alakoko kọọkan jẹ 0.1 ~ 1umol tabi 10 ~ 100pmol.O dara lati gbejade abajade ti a beere pẹlu iye ti o kere julọ ti alakoko.Idojukọ giga ti alakoko yoo fa aiṣedeede ati imudara ti kii ṣe pato, ati mu aye dagba awọn dimers laarin awọn alakoko.
2. Ifojusi akọkọ
Ifojusi ti awọn alakoko ni ipa lori pato.Idojukọ alakoko ti o dara julọ jẹ gbogbogbo laarin 0.1 ati 0.5μM.Awọn ifọkansi alakoko ti o ga julọ yori si imudara ti awọn ọja ti ko ni pato.
3. Annealing otutu ti alakoko
Omiiran pataki paramita fun awọn alakoko ni iwọn otutu yo (Tm).Eyi ni iwọn otutu nigbati 50% ti awọn alakoko ati awọn ilana ibaramu jẹ aṣoju bi awọn sẹẹli DNA oni-meji.A nilo Tm lati ṣeto iwọn otutu annealing PCR.Bi o ṣe yẹ, iwọn otutu annealing ti lọ silẹ to lati rii daju imunadoko annealing ti awọn alakoko pẹlu ọkọọkan ibi-afẹde, ṣugbọn ga to lati dinku isọdi ti ko ni pato.Awọn iwọn otutu annealing ti o tọ lati 55 ℃ si 70 ℃.Annealing otutu ti wa ni gbogbo ṣeto 5℃ kekere ju Tm ti alakoko.
Awọn agbekalẹ pupọ lo wa fun eto Tm, eyiti o yatọ pupọ da lori agbekalẹ ti a lo ati ọkọọkan awọn alakoko.Nitori ọpọlọpọ awọn agbekalẹ pese iye Tm ifoju, gbogbo awọn iwọn otutu annealing jẹ aaye ibẹrẹ nikan.Ni pato le ni ilọsiwaju nipasẹ itupalẹ ọpọlọpọ awọn aati ti o mu iwọn otutu annealing soke ni ilọsiwaju.Bẹrẹ ni isalẹ ti ifoju Tm-5℃, ati ni diėdiẹ mu iwọn otutu annealing pọ si ni ilọsiwaju ti 2℃.Awọn iwọn otutu annealing ti o ga julọ yoo dinku dida awọn dimers alakoko ati awọn ọja ti kii ṣe pato.Fun awọn abajade to dara julọ, awọn alakoko meji yẹ ki o ni awọn iye Tm isunmọ.Ti iyatọ Tm ti awọn orisii alakoko jẹ diẹ sii ju 5℃, awọn alakoko yoo ṣafihan ibẹrẹ eke pataki kan nipa lilo iwọn otutu annealing kekere ninu ọmọ.Ti awọn alakoko meji Tm ba yatọ, ṣeto iwọn otutu annealing si 5℃ kekere ju Tm ti o kere julọ.Ni omiiran, lati mu iyasọtọ pọ si, awọn iyipo marun le ṣee ṣe ni akọkọ ni awọn iwọn otutu annealing ti a ṣe apẹrẹ fun Tm ti o ga, atẹle nipa awọn iyipo ti o ku ni awọn iwọn otutu annealing ti a ṣe apẹrẹ fun Tm kekere.Eyi ngbanilaaye ẹda apa kan ti awoṣe opin irin ajo lati gba labẹ awọn ipo wiwọ.
4. Alakoko ti nw ati iduroṣinṣin
Iwa mimọ ti awọn alakoko aṣa jẹ deedee fun ọpọlọpọ awọn ohun elo PCR.Yiyọ ti benzoyl ati awọn ẹgbẹ isobutylyl nipasẹ desalting jẹ iwonba ati nitorina ko ni dabaru pẹlu PCR.Diẹ ninu awọn ohun elo nilo ìwẹnumọ lati yọkuro eyikeyi ti kii-kikun awọn ilana isọpọ.Awọn ilana ti a ge gige wọnyi waye nitori ṣiṣe ti kemistri kolaginni DNA kii ṣe 100%.Eyi jẹ ilana ipin ti o nlo awọn aati kẹmika leralera bi ipilẹ kọọkan ṣe ṣafikun lati ṣe DNA lati 3′ si 5′.O le kuna ni boya iyipo.Awọn alakoko gigun, paapaa awọn ti o tobi ju awọn ipilẹ 50, ni ipin ti o tobi ti awọn ilana ti a ge ati pe o le nilo isọdọmọ.
Awọn ikore ti awọn alakoko ni ipa nipasẹ ṣiṣe ti kemistri sintetiki ati ọna ìwẹnumọ.Awọn ile-iṣẹ Biopharmaceutical, gẹgẹ bi Cytology ati Shengong, gbogbo wọn lo ẹyọ OD ti o kere ju lati rii daju iṣelọpọ lapapọ ti oligonucleoside.Aṣa alakoko ti wa ni bawa ni gbẹ lulú fọọmu.O dara julọ lati tun awọn alakoko pada ni TE ki ifọkansi ikẹhin jẹ 100μM.TE dara ju omi ti a ti sọ diionized nitori pH ti omi nigbagbogbo jẹ ekikan ati pe yoo fa hydrolysis ti oligonucleosides.
Iduroṣinṣin ti awọn alakoko da lori awọn ipo ipamọ.Iyẹfun gbigbẹ ati awọn alakoko ti a tuka yẹ ki o wa ni ipamọ ni -20 ℃.Awọn alakoko tituka ni TE ni awọn ifọkansi ti o tobi ju 10μM le wa ni ipamọ ni iduroṣinṣin ni -20℃ fun awọn oṣu 6, ṣugbọn o le wa ni ipamọ nikan ni iwọn otutu yara (15℃ si 30℃) fun o kere ju ọsẹ 1.Awọn alakoko lulú gbigbẹ le wa ni ipamọ ni -20 C fun o kere ju ọdun kan ati ni iwọn otutu yara (15 C si 30 C) fun osu meji 2.
5. Awọn enzymu ati awọn ifọkansi wọn
Ni lọwọlọwọ, Taq DNA polymerase ti a lo jẹ ipilẹ ipilẹ-ẹrọ imọ-ẹrọ pupọ nipasẹ awọn kokoro arun coliform.Iye henensiamu ti o nilo lati ṣe itusilẹ iṣesi PCR aṣoju jẹ nipa 2.5U (tọkasi iwọn didun ifaseyin lapapọ ti 100ul).Ti ifọkansi ba ga ju, o le ja si imudara ti kii ṣe pato;ti ifọkansi ba kere ju, iye ọja sintetiki yoo dinku.
6. Didara ati ifọkansi ti dNTP
Didara dNTP ni ibatan pẹkipẹki si ifọkansi ati ṣiṣe ti imudara PCR.DNTP lulú jẹ granular, ati iyipada rẹ npadanu iṣẹ ṣiṣe ti ibi ti o ba wa ni ipamọ ti ko tọ.Ojutu dNTP jẹ ekikan, ati pe o yẹ ki o lo ni ifọkansi giga, pẹlu 1M NaOH tabi 1M Tris.HCL ojutu ifipamọ lati ṣatunṣe PH rẹ si 7.0 ~ 7.5, iye kekere ti iṣakojọpọ, ibi ipamọ tio tutunini ni -20℃.Ọpọ didi-thawing yoo dinku dNTP.Ni idahun PCR, dNTP yẹ ki o jẹ 50 ~ 200umol/L.Ni pataki, akiyesi yẹ ki o san si ifọkansi ti DNTPS mẹrin yẹ ki o jẹ dogba (igbaradi moolu dọgba).Ti ifọkansi eyikeyi ninu wọn ba yatọ si awọn miiran (ti o ga tabi isalẹ), ibaamu yoo ṣẹlẹ.Idojukọ kekere pupọ yoo dinku ikore ti awọn ọja PCR.dNTP le darapọ pẹlu Mg2+ ati dinku ifọkansi ti Mg2+ ọfẹ.
7. Àdàkọ (àkọlé pupọ) nucleic acid
Iye ati iwọn ìwẹnumọ ti acid nucleic awoṣe jẹ ọkan ninu awọn ọna asopọ bọtini fun aṣeyọri tabi ikuna ti PCR.Awọn ọna ìwẹnumọ DNA ti aṣa maa n lo SDS ati protease K lati dalẹ ati sọ awọn apẹrẹ kuro.Awọn iṣẹ akọkọ ti SDS ni: tu awọn lipids ati awọn ọlọjẹ lori awọ ara sẹẹli, nitorinaa ba pa awọ-ara sẹẹli run nipa sisọ awọn ọlọjẹ awo inu, ati awọn ọlọjẹ iparun kuro ninu sẹẹli, SDS tun le darapọ pẹlu awọn ọlọjẹ ati ṣaju;Protease K le ṣe hydrolyze ati ki o da awọn ọlọjẹ, paapaa awọn itan-akọọlẹ ti a so pẹlu DNA, ati lẹhinna lo phenol olomi Organic ati chloroform lati yọ awọn ọlọjẹ ati awọn paati sẹẹli miiran jade, ati lo ethanol tabi ọti isopropyl lati ṣaju acid nucleic.Acid nucleic ti a fa jade le ṣee lo bi awoṣe fun awọn aati PCR.Fun awọn ayẹwo wiwa ile-iwosan gbogbogbo, ọna iyara ati irọrun le ṣee lo lati tu awọn sẹẹli, awọn pathogens lysate, daijesti ati yọ awọn ọlọjẹ kuro lati awọn chromosomes si awọn jiini ibi-afẹde ọfẹ, ati lo taara fun imudara PCR.Iyọkuro awoṣe RNA maa n lo guanidine isothiocyanate tabi ọna protease K lati ṣe idiwọ RNase lati ba RNA jẹjẹ.
8.Mg2 + ifọkansi
Mg2 + ni ipa pataki lori pato ati ikore ti imudara PCR.Ni idahun PCR gbogbogbo, nigbati ifọkansi ti awọn oriṣiriṣi dNTP jẹ 200umol/L, ifọkansi ti o yẹ ti Mg2+ jẹ 1.5 ~ 2.0mmol/L.Idojukọ Mg2+ ga ju, pato ifakalẹ dinku, imudara ti kii ṣe pato waye, ifọkansi kekere pupọ yoo dinku iṣẹ ṣiṣe ti Taq DNA polymerase, ti o yorisi idinku awọn ọja ifaseyin.
Awọn ions iṣuu magnẹsia ni ipa lori awọn aaye pupọ ti PCR, gẹgẹbi iṣẹ ṣiṣe DNA polymerase, eyiti o ni ipa lori ikore;Apeere miiran jẹ annealing alakoko, eyiti o ni ipa lori pato.dNTP ati awoṣe sopọ mọ ion iṣuu magnẹsia, idinku iye ion iṣuu magnẹsia ọfẹ ti o nilo fun iṣẹ ṣiṣe henensiamu.Idojukọ iṣuu magnẹsia iṣuu magnẹsia ti o dara julọ yatọ fun awọn orisii alakoko ati awọn awoṣe oriṣiriṣi, ṣugbọn aṣoju PCR ti o bẹrẹ ifọkansi pẹlu 200μM dNTP jẹ 1.5mM (akọsilẹ: Fun PCR pipo akoko gidi, lo 3 si 5mM iṣuu magnẹsia ion ojutu pẹlu iwadii fluorescent).Awọn ifọkansi ti o ga julọ ti awọn ions iṣuu magnẹsia ọfẹ mu ikore pọ si, ṣugbọn tun mu imudara ti ko ni pato pọ si ati dinku iṣotitọ.Lati pinnu ifọkansi ti o dara julọ, awọn titrations ion magnẹsia ni a ṣe ni awọn ilọsiwaju ti 0.5mM lati 1mM si 3mM.Lati dinku igbẹkẹle lori iṣapeye ion iṣuu magnẹsia, Platinum Taq DNA polymerase le ṣee lo.Platinum Taq DNA polymerase ni anfani lati ṣetọju iṣẹ lori iwọn titobi ti awọn ifọkansi ion iṣuu magnẹsia ju Taq DNA polymerase ati nitorinaa nilo iṣapeye kere si.
9. Awọn afikun igbega PCr
Imudara iwọn otutu annealing, apẹrẹ alakoko, ati ifọkansi ion iṣuu magnẹsia ti to fun imudara kan pato ti awọn awoṣe pupọ julọ;sibẹsibẹ, diẹ ninu awọn awoṣe, pẹlu awọn ti o ni akoonu GC giga, nilo awọn igbese afikun.Awọn afikun ti o ni ipa lori iwọn otutu yo ti DNA pese ọna miiran lati mu ilọsiwaju ọja ni pato ati ikore.Denaturation kikun ti awoṣe ni a nilo fun awọn abajade to dara julọ.
Ni afikun, eto ile-atẹle ṣe idilọwọ abuda alakoko ati itẹsiwaju enzymu.
Awọn afikun PCR, pẹlu formamide, DMSO, glycerin, betaine, ati PCRx Imudara Solusan, mu imudara pọ si.Ilana ti o ṣeeṣe wọn ni lati dinku iwọn otutu yo, nitorinaa ṣe iranlọwọ fun isunmọ ti awọn alakoko ati iranlọwọ itẹsiwaju DNA polymerase nipasẹ agbegbe igbekalẹ keji.PCRx Solusan ni awọn anfani miiran.Imudara ion iṣuu magnẹsia ti o kere julọ nilo nigba lilo pẹlu Platinum Taq DNA polymerase ati Platinum Pfx DNA polymerase.Nitorinaa, ilana Platinum ni idapo pẹlu afikun lati mu iyasọtọ pọ si lakoko ti o dinku igbẹkẹle ti ọna kẹta, iṣapeye ion iṣuu magnẹsia.Fun awọn abajade to dara julọ, ifọkansi ti awọn afikun yẹ ki o wa ni iṣapeye, paapaa DMSO, formamide, ati glycerol, eyiti o dẹkun Taq DNA polymerase.
10. gbona ibere
Gbona PCR jẹ ọkan ninu awọn ọna pataki julọ lati mu ilọsiwaju PCR ni afikun si apẹrẹ alakoko to dara.Botilẹjẹpe iwọn otutu elongation ti o dara julọ ti Taq DNA polymerase jẹ 72℃, polymerase wa lọwọ ni iwọn otutu yara.Nitorinaa, awọn ọja ti kii ṣe pato ni a ṣejade nigbati iwọn otutu dani ba kere ju iwọn otutu annealing lakoko igbaradi ti iṣe PCR ati ni ibẹrẹ ti iwọn otutu.Ni kete ti o ti ṣẹda, awọn ọja ti kii ṣe pato ni imunadoko.PCR-ibẹrẹ gbigbona jẹ imunadoko paapaa nigbati awọn aaye ti a lo fun apẹrẹ alakoko ni opin nipasẹ ipo awọn eroja jiini, gẹgẹbi awọn iyipada ti aaye-itọnisọna, ikosile ikosile, tabi ikole ati ifọwọyi ti awọn eroja jiini ti a lo fun imọ-ẹrọ DNA.
Ọna ti o wọpọ lati ṣe idinwo iṣẹ ṣiṣe ti Taq DNA polymerase ni lati mura ojutu ifa PCR lori yinyin ati gbe sinu ohun elo PCR ti o ti ṣaju.Ọna yii rọrun ati ilamẹjọ, ṣugbọn ko pari iṣẹ ṣiṣe ti henensiamu ati nitorinaa ko ṣe imukuro imudara ti awọn ọja ti kii ṣe pato.
Alakoko igbona ṣe idaduro iṣelọpọ DNA nipasẹ didi paati pataki titi ohun elo PCR yoo de iwọn otutu denaturation.Pupọ julọ awọn ọna ifilọlẹ igbona afọwọṣe, pẹlu afikun idaduro ti Taq DNA polymerase, jẹ alaiwu, pataki fun awọn ohun elo ti o ga.Awọn ọna alakoko gbigbona miiran lo aabo epo-eti lati paamọ paati pataki, pẹlu awọn ions magnẹsia tabi awọn ensaemusi, tabi lati ya sọtọ awọn paati ifaseyin ti ara, gẹgẹbi awọn awoṣe ati awọn buffers.Lakoko yiyi ti o gbona, awọn oriṣiriṣi awọn paati ni a tu silẹ ati dapọ papọ bi epo-eti ṣe nyọ.Bii ọna ibẹrẹ gbigbona afọwọṣe, ọna aabo epo-eti jẹ cumbersome ati itara si idoti ati pe ko dara fun awọn ohun elo iṣelọpọ giga.
Platinum DNA polymerase rọrun ati lilo daradara fun PCR ibẹrẹ gbigbona laifọwọyi.Platinum Taq DNA polymerase ni atunpo Taq DNA polymerase ni idapo pẹlu egboogi monoclonal lodi si Taq DNA polymerase.Awọn ajẹsara jẹ agbekalẹ nipasẹ PCR lati ṣe idiwọ iṣẹ ṣiṣe enzymu lakoko didimu iwọn otutu gigun.Taq DNA polymerase ni idasilẹ sinu iṣesi lakoko idabobo 94 ℃ ti igbese denaturation, mimu-pada sipo iṣẹ ṣiṣe polymerase ni kikun.Ni idakeji si kemikali Taq DNA polymerase ti a ṣe atunṣe fun ibẹrẹ gbona, enzymu Platinum ko nilo idabobo gigun ni 94 ℃ (iṣẹju 10 si 15) lati mu polymerase ṣiṣẹ.Pẹlu PlatinumTaq DNA polymerase, 90% ti iṣẹ ṣiṣe Taq DNA polymerase ti mu pada lẹhin awọn iṣẹju 2 ni 94℃.
11. Itẹ-ẹiyẹ-PCR
Awọn iyipo aṣeyọri ti imudara nipa lilo awọn alakoko ti itẹ-ẹi le ṣe ilọsiwaju ni pato ati ifamọ.Ni igba akọkọ ti yika ni a boṣewa ampilifaya ti 15 to 20 waye.Ida kan ti ọja imudara akọkọ ti fomi ni awọn akoko 100 si 1000 ati ṣafikun si iyipo keji ti imudara fun awọn akoko 15 si 20.Ni omiiran, ọja imudara akọkọ le jẹ iwọn nipasẹ iwẹnumọ gel.A lo alakoko ti o ni itẹ-ẹiyẹ ni iyipo keji ti imudara, eyiti o le sopọ mọ ọkọọkan ibi-afẹde inu alakoko akọkọ.Lilo PCR ti itẹ-ẹiyẹ dinku iṣeeṣe ti imudara ti awọn aaye ibi-afẹde lọpọlọpọ nitori pe awọn ilana ibi-afẹde diẹ ni o wa ni ibamu si awọn ipilẹ mejeeji ti awọn alakoko.Nọmba apapọ awọn iyipo kanna (30 si 40) pẹlu awọn alakoko kanna ṣe alekun awọn aaye ti ko ni pato.PCR ti o ni itẹ-ẹi ṣe alekun ifamọ ti awọn ilana ibi-afẹde to lopin (fun apẹẹrẹ, mrnas toje) ati ilọsiwaju ni pato ti PCRS ti o nira (fun apẹẹrẹ 5′ RACE).
12. PCR sọkalẹ
Ilọkalẹ PCR ṣe ilọsiwaju ni pato nipa lilo awọn ipo annealing wiwọ fun awọn akoko diẹ akọkọ ti PCR.Yiyiyi bẹrẹ ni iwọn otutu annealing isunmọ 5℃ ti o ga ju Tm ti a pinnu, lẹhinna ọmọ kọọkan dinku nipasẹ 1℃ si 2℃ titi ti iwọn otutu annealing wa ni isalẹ Tm 5℃.Awoṣe opin irin ajo nikan pẹlu homology ti o ga julọ yoo jẹ imudara.Awọn ọja wọnyi tẹsiwaju lati faagun ni awọn iyipo ti o tẹle, ti npọpọ awọn ọja ti kii ṣe pato.Ti sọkalẹ PCR jẹ iwulo fun awọn ọna nibiti a ko mọ iwọn ti homology laarin alakoko ati awoṣe ibi-afẹde, gẹgẹbi titẹ ika ika AFLP DNA.
Jẹmọ PCR Kits
2× PCR akoniTMMix eto ni o ni ti o ga ifarada to PCR inhibitors ju arinrin PCR Mix eto, ati ki o le awọn iṣọrọ bawa pẹlu PCR ampilifaya ti awọn orisirisi eka awoṣe.Eto ifa alailẹgbẹ ati ṣiṣe giga Taq Hero jẹ ki iṣe PCR ni ṣiṣe imudara ti o ga julọ, pato ati ifamọ.
Ti o ga ampilifaya ṣiṣe
O ni iṣẹ-ṣiṣe 5'→ 3' DNA polymerase ati 5'→ 3' iṣẹ exonuclease, laisi 3'→ 5' iṣẹ exonuclease.
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Ipilẹ-iṣapeye ni pato ati itanna Taq ti o gbona le ṣe idiwọ imudara ti kii ṣe pato ati dida dimer alakoko
Ifamọ giga-le ṣe awari awọn ẹda kekere ti awoṣe
Ohun elo naa nlo iyasọtọ Foregene yiyipada reagent transcription ati Foregene HotStar Taq DNA Polymerase ni idapo pẹlu eto ifalọ alailẹgbẹ lati mu imunadoko imudara imudara ati pato ifa.
Akoko ifiweranṣẹ: May-09-2023
