Ninu awọn adanwo qPCR, apẹrẹ alakoko tun jẹ ọna asopọ pataki pupọ.Boya awọn alakoko ba dara tabi rara jẹ ibatan pẹkipẹki boya ṣiṣe imudara naa de iwọn boṣewa, boya awọn ọja ti o pọ si ni pato, ati boya awọn abajade idanwo wa.
Nitorinaa bii o ṣe le jẹ ki pato alakoko qPCR dara julọ?Imudara imudara giga?
Loni, a yoo mu ọ lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko qPCR papọ, ati jẹ ki apẹrẹ alakoko qPCR di ọgbọn lore ti o munadoko ninu awọn adanwo.
Nigbati o ba n ṣe apẹrẹ awọn alakoko qPCR, nigbagbogbo ṣe akiyesi si awọn aaye wọnyi: awọn alakoko yẹ ki o ṣe apẹrẹ kọja awọn introns bi o ti ṣee ṣe, ipari ọja yẹ ki o jẹ 100-300 bp, iye Tm yẹ ki o sunmọ bi o ti ṣee ṣe si 60 ° C, ati awọn alakoko oke ati isalẹ yẹ ki o sunmọ bi o ti ṣee, ati ipari ti alakoko yẹ ki o jẹ G tabi C, ati bẹbẹ lọ.
1. Apẹrẹ ti awọn alakoko leta ti introns
Nigbati o ba n ṣe apẹrẹ awọn alakoko qPCR, yiyan awọn alakoko ti a ṣe apẹrẹ kọja awọn introns le ṣe idiwọ awoṣe gDNA lati ni imudara, ati pe gbogbo awọn ọja naa ni yo lati imudara ti cDNA, nitorinaa imukuro ipa ti koti gDNA.
2. Ipari alakoko
Gigun alakoko jẹ gbogbogbo laarin 18-30 NT, ati ipari ti ọja imudara yẹ ki o ṣakoso laarin 100-300 bp bi o ti ṣee ṣe.
Ti alakoko ba kuru ju, yoo yorisi imudara ti kii ṣe pato, ati pe ti o ba gun ju, yoo ni irọrun ṣe agbekalẹ eto-atẹle (gẹgẹbi ilana irun irun).Ti ọja imudara ba gun ju, ko dara fun iṣesi ti polymerase, eyiti yoo ni ipa lori ṣiṣe ti imudara PCR.
3. GC akoonu ati Tm iye
Akoonu GC ti awọn alakoko yẹ ki o ṣakoso laarin 40% ati 60%.Ti o ba ga ju tabi lọ silẹ ju, ko ni itara si pilẹṣẹ iṣesi naa.Akoonu GC ti awọn alakoko iwaju ati yiyipada yẹ ki o wa nitosi si kanna lati le gba iye Tm kanna ati iwọn otutu annealing.
Iwọn Tm yẹ ki o wa laarin 55-65°C bi o ti ṣee ṣe, ni gbogbogbo ni ayika 60°C, ati pe iye Tm ti oke ati isalẹ yẹ ki o wa ni isunmọ bi o ti ṣee, ni pataki ko ju 4°C lọ.
4. Yago fun yiyan A ni 3′ opin alakoko
Nigbati ipari 3 ′ alakoko ko baamu, awọn iyatọ nla wa ninu ṣiṣe iṣelọpọ ti awọn ipilẹ oriṣiriṣi.Nigbati ipilẹ ti o kẹhin jẹ A, o tun le bẹrẹ iṣelọpọ pq paapaa ninu ọran ti aiṣedeede, ati nigbati ipilẹ ti o kẹhin jẹ T Nigbati, ṣiṣe ti ifasilẹ aiṣedeede ti dinku pupọ.Nitorinaa, gbiyanju lati yago fun yiyan A ni opin 3′ ti alakoko, ati pe o dara lati yan T.
Ti o ba jẹ alakoko iwadii, ipari 5 ′ ti iwadii naa ko le jẹ G, nitori paapaa nigbati ipilẹ G kan ba sopọ si ẹgbẹ onirohin FAM fluorescent, G tun le pa ami ifihan fluorescent ti o jade nipasẹ ẹgbẹ FAM, ti o yorisi awọn abajade odi eke.Farahan.
5. Pinpin mimọ
Pipin awọn ipilẹ mẹrin ni alakoko jẹ laileto laileto, yago fun diẹ sii ju 3 itẹlera G tabi C ni ipari 3′, ati diẹ sii ju 3 ni itẹlera.G tabi C rọrun lati ṣe ipilẹṣẹ isọpọ ni agbegbe-ọlọrọ GC.
6. Agbegbe apẹrẹ alakoko yẹ ki o yago fun awọn ẹya ile-ẹkọ keji ti eka.
Eto Atẹle ti a ṣẹda nipasẹ okun ẹyọkan ti ọja imudara yoo ni ipa lori ilọsiwaju didan ti PCR.Nipa asọtẹlẹ boya eto-atẹle kan wa ni ọna ibi-afẹde ni ilosiwaju, gbiyanju lati yago fun agbegbe yii ni apẹrẹ awọn alakoko.
7. Awọn alakoko funrararẹ ati laarin awọn alakoko yẹ ki o gbiyanju lati yago fun awọn ipilẹ ibaramu itẹlera.
Ko le jẹ ibaramu ipilẹ 4 itẹlera laarin alakoko funrararẹ ati alakoko.Alakoko funrararẹ ko yẹ ki o ni ọna ti o ni ibamu, bibẹẹkọ o yoo ṣe agbo ara rẹ lati ṣe agbekalẹ irun-awọ, eyiti yoo ni ipa lori apapo annealing ti alakoko ati awoṣe.
Awọn ilana ibaramu ko le wa laarin awọn alakoko oke ati isalẹ.Ibaramu laarin awọn alakoko yoo ṣe awọn dimers alakoko, eyiti yoo dinku ṣiṣe PCR ati paapaa ni ipa lori deede iwọn.Ti alakoko-dimer ati awọn ẹya irun ko ṣee ṣe, iye △G ko yẹ ki o ga ju (yẹ ki o jẹ kere ju 4.5 kcal/mol).
8. Awọn alakoko mu ọja kan pato ibi-afẹde pọ si.
Ibi-afẹde ti o ga julọ ti wiwa qPCR ni lati loye opo ti jiini ibi-afẹde.Ti imudara ti kii ṣe pato ba waye, titobi yoo jẹ aiṣedeede.Nitorinaa, lẹhin ti a ṣe apẹrẹ awọn alakoko, wọn nilo lati ni idanwo nipasẹ BLAST, ati pe pato ti awọn ọja ni a ṣe afiwe ni data data lẹsẹsẹ.
Nigbamii ti, a mu GAS6 eniyan (Growth arrest pato 6) pupọ bi apẹẹrẹ lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko qPCR.
01 ibeere Jiini
Homo GAS6nipasẹ NCBI.Nibi, o yẹ ki a san ifojusi si ifiwera orukọ apilẹṣẹ ati eya lati rii daju pe wọn wa ni ibamu.
02 Wa lẹsẹsẹ-jiini
(1) Ti ọkọọkan ibi-afẹde ba jẹ DNA genomic, yan akọkọ, eyiti o jẹ ilana DNA jinomiki ti jiini.
(2) Ti ọna ibi-afẹde ba jẹ mRNA, yan ọkan keji.Lẹhin titẹ sii, tẹ “CDS” ninu tabili ni isalẹ.Ọkọọkan lẹhin brown jẹ ilana ifaminsi ti pupọ.
03 Design alakoko
Tẹ wiwo alakoko-BLAST sii
Tẹ nọmba ọkọọkan pupọ sii tabi ọkọọkan ni ọna kika Fasta ni apa osi oke, ati fọwọsi awọn aye ti o yẹ.

Tẹ “Gba awọn alakoko” ati NCBI yoo gbe jade lati sọ fun ọ pe iru yiyan paramita yoo jẹ imudara si awọn iyatọ splicing miiran.A le ṣayẹwo awọn iyatọ splicing ti o yatọ ati fi wọn silẹ lati gba bata alakoko ti o yẹ (gẹgẹbi a ṣe han ninu nọmba ni isalẹ).Ilana yi le gba to mewa ti aaya lati ṣiṣe.
Awọn iwọn otutu annealing ti awọn orisii alakoko wọnyi wa ni ayika 60°C.Ni ibamu si awọn idi ti awọn ṣàdánwò, yan awọn alakoko pẹlu dede ipari, ti o dara ni pato ati ki o kere ara-complementation ti awọn alakoko fun awọn ṣàdánwò, ati awọn aseyori oṣuwọn jẹ ohun ga!
04Primer pato ijerisi
Ni otitọ, ni afikun si sisọ awọn alakoko, Primer-Blast tun le ṣe iṣiro awọn alakoko ti a ṣe apẹrẹ funrara wa.Pada si oju-iwe apẹrẹ alakoko, tẹ awọn ipilẹṣẹ oke ati isalẹ ti a ṣe apẹrẹ, ati pe awọn paramita miiran kii yoo tunṣe.Lẹhin ifisilẹ, o le rii boya bata ti alakoko tun wa lori awọn jiini miiran.Ti gbogbo wọn ba han lori jiini ti a fẹ lati pọ si, nfihan pe pato ti bata alakoko yii jẹ nla!(Fun apẹẹrẹ, eyi nikan ni abajade ti ibeere alakoko!)

05 Alakoko didara idajọ
Iru alakoko wo ni alakoko “pipe” ti o daapọ “ṣiṣe imudara soke si boṣewa”, “awọn abuda ọja imudara”, ati “awọn abajade esiperimenta ti o gbẹkẹle”?
Imudara imudara

yo ti tẹ
Imudara imudara ti awọn alakoko de ọdọ 90% -110%, eyi ti o tumọ si pe imudara imudara dara, ati iṣipopada yo ni tente oke kan ati nigbagbogbo Tm> 80 ° C, eyiti o tumọ si pe iyasọtọ imudara dara.
 
Awọn ọja ti o jọmọ:
Akoko Gidi PCR Rọrun – SYBR GREEN I
Real Time PCR Easy-Taqman