PCR Akoko Gidi, ti a tun mọ ni pipo PCR tabi qPCR, jẹ ọna fun ibojuwo akoko gidi ati itupalẹ awọn ọja imudara PCR.
Nitori PCR pipo ni awọn anfani ti iṣiṣẹ ti o rọrun, iyara ati irọrun, ifamọ giga, atunṣe to dara, ati oṣuwọn idoti kekere, o jẹ lilo pupọ ni idanwo iṣoogun, igbelewọn ipa oogun, iwadii ikosile pupọ, iwadii transgenic, wiwa jiini, wiwa pathogen, ẹranko ati wiwa ọgbin., idanwo ounje ati awọn aaye miiran.
Nitorinaa, boya o n ṣiṣẹ ni iwadii ipilẹ ni awọn imọ-jinlẹ igbesi aye, tabi awọn oṣiṣẹ ti awọn ile-iṣẹ elegbogi, awọn ile-iṣẹ igbẹ ẹranko, awọn ile-iṣẹ ounjẹ, tabi paapaa awọn oṣiṣẹ ti ayewo iwọle-ijade ati awọn bureaus quarantine, awọn apa ibojuwo ayika, awọn ile-iwosan ati awọn ẹya miiran, iwọ yoo jẹ diẹ sii tabi kere si fara si Tabi o nilo lati mọ imọ ti ṣiṣakoso PCR pipo.

Ilana ti Real Time PCR

Real Time PCR ni a ọna ninu eyi ti Fuluorisenti oludoti wa ni afikun si awọn PCR lenu eto, ati fluorescence kikankikan ninu awọn ilana ti PCR lenu ti wa ni abojuto ni akoko gidi nipa a pipo PCR irinse, ati nipari awọn esiperimenta data ti wa ni atupale ati ni ilọsiwaju.

【Amúṣantóbi ti tẹ】ni awọn ti tẹ apejuwe awọn ìmúdàgba ilana ti PCR.Ipilẹ imudara ti PCR kii ṣe oju-ọna ti o niiṣe deede, ṣugbọn ọna sigmoid kan.

[Abala Platform ti ìsépo ìmúgbòòrò]Pẹlu ilosoke ti nọmba awọn iyipo PCR, aiṣiṣẹ ti DNA polymerase, idinku awọn dNTPs ati awọn alakoko, ati idinamọ iṣesi iṣelọpọ nipasẹ ifaseyin nipasẹ-ọja pyrophosphate, bbl, PCR ko nigbagbogbo faagun ni afikun., ati ki o yoo bajẹ wọ a Plateau.

[Agbegbe Growth Apejuwe ti Iyipada Amugba]Botilẹjẹpe ipele Plateau yatọ pupọ, ni agbegbe kan ti agbegbe idagbasoke ti o pọju ti ọna imudara, atunwi jẹ dara pupọ, eyiti o ṣe pataki pupọ fun itupalẹ pipo ti PCR.

[Iye ẹnu-ọna ati iye Ct]A ṣeto iye opin ti iṣawari fluorescence ni ipo ti o yẹ ni agbegbe idagbasoke ti o pọju ti ohun ti tẹ titobi, eyun iye ala-ilẹ (Ipele).Ikorita ti iye ala-ilẹ ati igbi imudara jẹ iye Ct, iyẹn ni, iye Ct tọka si nọmba awọn iyika (Iwọn ila-ilẹ) nigbati iye ala ti de.

Aworan ti o wa ni isalẹ fihan ni kedere ibatan laarin laini iloro ati ọna imudara, iloro ati iye Ct.

【Bawo ni lati ṣe iwọn?】

O ti fi idi rẹ mulẹ nipasẹ imọ-jinlẹ mathematiki pe iye Ct ni ibatan laini onidakeji pẹlu logarithm ti nọmba awọn awoṣe akọkọ.Real Time PCR ṣe abojuto awọn ọja imudara PCR ni akoko gidi ati ṣe iwọn wọn lakoko ipele imudara iwọn.

Fun yiyipo PCR kọọkan, DNA pọ si ni afikun nipasẹ awọn akoko 2, ati laipẹ de ibi giga kan.

A ro pe iye DNA ti o bẹrẹ jẹ A₀ , lẹhin awọn iyipo n, iye imọ-jinlẹ ti ọja DNA le ṣe afihan bi:

A _n =A ₀ ×2ⁿ

Lẹhinna, diẹ sii ni iye DNA ibẹrẹ A 0, ni kete ti iye ọja ti o pọ si de iye wiwa An, ati nọmba awọn iyipo nigbati o ba de An ni iye Ct.Iyẹn ni, diẹ sii diẹ sii iye DNA ibẹrẹ A 0, ni iṣaaju ni iṣaju iṣaju iṣaju, ati pe nọmba ti a beere fun awọn iyipo n kere si.

A ṣe dilution gradient ti boṣewa ti ifọkansi ti a mọ ati lo bi awoṣe fun PCR Akoko Gidi, ati pe lẹsẹsẹ ti awọn iha imudara yoo gba ni awọn aaye arin dogba ni aṣẹ ti ibẹrẹ iye DNA lati diẹ sii si kere si.Gẹgẹbi ibatan laini laarin iye Ct ati logarithm ti nọmba awọn awoṣe ibẹrẹ, a[boṣewa ti tẹ] le ṣẹda.

Nipa rirọpo iye Ct ti ayẹwo pẹlu ifọkansi aimọ sinu ọna kika boṣewa, iwọn awoṣe ibẹrẹ ti ayẹwo pẹlu ifọkansi aimọ le ṣee gba, eyiti o jẹ ipilẹ pipo ti PCR Akoko Gidi.

Erin ọna ti Real Time PCR

Real Time PCR ṣe awari awọn ọja imudara PCR nipa wiwa kikankikan fluorescence ninu eto ifaseyin.

Ilana ti Ọna Imudanu Fluorescent Dye】

Awọn awọ Fuluorisenti, gẹgẹ bi awọn TB Green ® , le nonspecifically dè si ni ilopo-stranded DNA ni PCR awọn ọna šiše ati fluoresce lori abuda.

Kikankikan fluorescence ninu eto ifaseyin pọ si lọpọlọpọ pẹlu ilosoke ti awọn iyipo PCR.Nipa wiwa kikankikan fluorescence, iye imudara DNA ninu eto ifaseyin le ṣe abojuto ni akoko gidi, ati lẹhinna iye awoṣe ibẹrẹ ninu apẹẹrẹ le jẹ ifoju ifojusọna.

【Ilana ti ọna iwadii Fuluorisenti】

Fuluorisenti ibereni a nucleic acid ọkọọkan pẹlu kan Fuluorisenti ẹgbẹ ni 5 "opin ati ki o kan quenching ẹgbẹ ni 3" opin, eyi ti o le pataki dè si awọn awoṣe.Nigbati iwadii ba wa ni mimule, itanna ti o jade nipasẹ fluorophore ti wa ni pipa nipasẹ ẹgbẹ ti npa ati pe ko le tan imọlẹ.Nigbati iwadii ba jẹ jijẹ, nkan Fuluorisenti yoo yapa ati ki o jade kuro ni fluorescence.

Ayẹwo Fuluorisenti ti wa ni afikun si ojutu esi esi PCR.Lakoko ilana imuduro, iwadii Fuluorisenti yoo sopọ mọ ipo kan pato ti awoṣe naa.Lakoko ilana itẹsiwaju, iṣẹ 5′→ 3′ exonuclease ti enzymu PCR le decompose iwadii fluorescent hybridized pẹlu awoṣe, ati nkan ti Fuluorisenti ti yapa lati yọkuro fluorescence.Nipa wiwa kikankikan fluorescence ti iwadii ninu eto ifaseyin, idi ti ibojuwo iye imudara ti ọja PCR le ṣaṣeyọri.

【Asayan ti Fluorescence erin Ọna】

Ti a ba lo lati ṣe iyatọ awọn ilana pẹlu homology giga ati ṣiṣe wiwa PCR multiplex gẹgẹbi iṣiro titẹ SNP, ọna iwadii Fuluorisenti ko ni rọpo.
Fun awọn adanwo PCR Real Time miiran, ọna ti o rọrun, irọrun ati idiyele kekere ti o le lo ọna chimera fluorescent.

probesStrong pato, o lagbara ti multiplex PCR

Aipe

Awọn ibeere pataki ti o ga julọ fun imudara;

multiplex PCR ko ṣee ṣeNilo lati ṣe apẹrẹ awọn iwadii kan pato, idiyele giga;

ma ibere oniru jẹ soro

Awọn ọja ti o jọmọ: