PCR jẹ imọ-ẹrọ imudara acid nucleic ti o gbajumo julọ ati pe o jẹ lilo pupọ nitori ifamọ ati pato rẹ.Bibẹẹkọ, PCR nilo denaturation gbigbona leralera ati pe ko le yọkuro awọn idiwọn ti gbigbekele awọn ohun elo ati ohun elo, eyiti o ṣe idiwọ ohun elo rẹ ni idanwo aaye ile-iwosan.

Lati ibẹrẹ awọn ọdun 1990, ọpọlọpọ awọn ile-iṣere ti bẹrẹ lati ṣe agbekalẹ imọ-ẹrọ imudara iwọn otutu igbagbogbo ti ko nilo denaturation gbona.Ni bayi wọn ti ni idagbasoke imọ-ẹrọ imudara isothermal media media, okun rirọpo isothermal ampilifaya, imọ-ẹrọ imudara isothermal Circle isothermal, ati igbẹkẹle lẹsẹsẹ acid nucleic.Imọ-ẹrọ imudara Isothermal ati awọn imọ-ẹrọ miiran. 

Loop-mediated isothermal ampilifaya

Ilana imudara naa da lori otitọ pe DNA wa ni ipo iwọntunwọnsi ti o ni agbara ni iwọn 65°C.Nigba ti eyikeyi alakoko ba ni ipilẹ-so pọ ati ti o gbooro si apakan ibaramu ti DNA oni-meji, okun miiran yoo yapa yoo di alakan.

Ni iwọn otutu yii, DNA nlo awọn alakoko 4 kan pato lati gbẹkẹle DNA polymerase ti o nipo okun lati jẹ ki iṣelọpọ ti okun-nipo DNA ti ara ẹni ṣe kaakiri nigbagbogbo.

Ni akọkọ pinnu awọn agbegbe 6 kan pato F3, F2, F1, B1, B2, B3 lori jiini ibi-afẹde, ati lẹhinna ṣe apẹrẹ awọn alakoko 4 ti o da lori awọn agbegbe 6 pato (gẹgẹbi a ṣe han ninu nọmba ni isalẹ):

Alakoko inu iwaju (FIP) jẹ ti F1c ati F2.

Alakoko inu ti ẹhin (BIP) jẹ ti B1c ati B2, ati TTTT ti a lo bi alafo ni aarin.

Awọn alakoko ita F3 ati B3 jẹ lẹsẹsẹ F3 ati awọn agbegbe B3 lori jiini ibi-afẹde.

Ninu eto ifasilẹ LAMP, ifọkansi ti alakoko inu jẹ ọpọlọpọ igba ti alakoko ita.Alakoko inu ti wa ni idapo akọkọ pẹlu okun awoṣe lati ṣajọpọ okun to baramu lati ṣe okun meji DNA kan.Lẹhinna, alakoko ita ti wa ni idapo pẹlu okun awoṣe lati ṣe okun meji DNA kan.Labẹ iṣe ti BstDNA polymerase, okun ibaramu ti a ṣepọ nipasẹ alakoko inu jẹ idasilẹ.Lẹhin lẹsẹsẹ awọn aati, okun ibaramu nikẹhin ṣe agbekalẹ okun DNA kan ṣoṣo pẹlu eto dumbbell kan.

Ẹya dumbbell DNA okun ẹyọkan funrarẹ ni a lo bi awoṣe lati ṣe agbekalẹ nigbagbogbo DNA ọna gbigbe-yipo pẹlu opin ṣiṣi.Inu ati ita awọn alakoko ṣe itọsọna ọna gbigbe ti yio-lupu DNA lati faragba nipo okun nigbagbogbo ati awọn aati ifaagun, ati nikẹhin ṣe agbekalẹ awọn ẹya-yipo pupọ pẹlu awọn gigun oriṣiriṣi.DNA adalu.

Awọn anfani ati awọn aila-nfani ti ampilifaya isothermal ti o ni agbedemeji lupu

Awọn anfani ti LAMP:

(1) Ṣiṣe imudara giga, eyiti o le ṣe imunadoko awọn ẹda 1-10 ti jiini ibi-afẹde laarin 1h, ati ṣiṣe imudara jẹ awọn akoko 10-100 ti PCR lasan.

(2) Akoko ifarahan jẹ kukuru, pato ni agbara, ko si si ohun elo pataki ti a beere.

Awọn aito ti LAMP:

(1) Awọn ibeere fun awọn alakoko jẹ giga julọ.

(2) Ọja imudara ko le ṣee lo fun ti ẹda oniye ati titele, ṣugbọn o le ṣee lo fun idajọ nikan.

(3) Nitori ifamọ ti o lagbara, o rọrun lati ṣe awọn aerosols, nfa awọn idaniloju eke ati ni ipa awọn abajade idanwo naa.

Strand nipo ampilifaya

Imudara ipapopada Strand (SDA) jẹ ilana imudara DNA isothermal in vitro ti o da lori ifa enzymatic ti akọkọ dabaa nipasẹ ọmọ ile-iwe Amẹrika Walker ni ọdun 1992.

Eto ipilẹ ti SDA pẹlu endonuclease ihamọ, polymerase DNA kan pẹlu iṣẹ iṣipopada okun, awọn orisii meji ti awọn alakoko, dNTPs, ati kalisiomu ati awọn ions magnẹsia ati awọn eto ifipamọ.

Ilana ti imudara nipo okun da lori kemikali títúnṣe hihamọ endonuclease ọkọọkan idanimọ ni awọn opin mejeeji ti DNA afojusun.Awọn endonuclease ṣii aafo ni okun DNA ni aaye idanimọ rẹ, ati pe DNA polymerase fa aafo naa 3′ Ipari ati rọpo okun DNA ti o tẹle.

Awọn okun ẹyọkan ti a rọpo ti DNA le ni idapo pelu awọn alakoko ati fa siwaju si awọn okun meji nipasẹ DNA polymerase.Yi ilana ti wa ni tun lemọlemọfún, ki awọn afojusun ọkọọkan ti wa ni imudara daradara.

Awọn anfani ati awọn aila-nfani ti imọ-ẹrọ imudara nipo okun

Awọn anfani ti SDA:

Imudara imudara jẹ giga, akoko ifarabalẹ jẹ kukuru, pato jẹ lagbara, ko si si ohun elo pataki ti a beere.

Awọn aito SDA:

Awọn ọja naa ko jẹ aṣọ, ati diẹ ninu awọn ọja ti o ni ẹyọkan ati awọn ọja ti o ni ilopo meji nigbagbogbo ni a ṣejade ni ọna SDA, ati pe iru yoo ṣẹlẹ laiseaniani nigbati a ba rii nipasẹ electrophoresis.

Rolling Circle ampilifaya

Yiyi Circle ampilifaya (RCA) ti wa ni dabaa nipa yiya lori ọna ti didakọ DNA lati pathogenic oganisimu nipa yiyi Circle.O tọka si lilo DNA ipin kan-okun bi awoṣe ni iwọn otutu igbagbogbo, ati DNA polymerase pataki kan (bii Phi29) ) Labẹ iṣẹ ti yiyi iyika DNA kolaginni lati ṣaṣeyọri imudara ti jiini ibi-afẹde.

RCA ni a le pin si imudara laini ati imudara alapin.Iṣiṣẹ ti RCA laini le de ọdọ 10⁵igba, ati ṣiṣe ti exponential RCA le de ọdọ 10⁹igba.

Iyatọ ti o rọrun, bi o ṣe han ninu nọmba ti o wa ni isalẹ, imudara laini kan nlo 1 alakoko nikan, ampilifaya ampilifaya b ni awọn alakoko 2.

Linear RCA tun npe ni RCA alakoko kan.Alakoko sopọ mọ DNA ipin ati pe o gbooro nipasẹ iṣẹ ti DNA polymerase.Ọja naa jẹ okun ẹyọkan laini pẹlu nọmba nla ti awọn ilana atunwi ẹgbẹẹgbẹrun awọn akoko gigun ti lupu ẹyọkan.

Niwọn igba ti ọja ti RCA laini ti sopọ nigbagbogbo si alakoko ibẹrẹ, imuduro irọrun ti ifihan jẹ anfani pataki kan.

Exponential RCA, tun mo bi Hyper branched ampilifaya HRCA (Hyper branched RCA), ni exponential RCA, ọkan alakoko amplifies awọn RCA ọja, awọn keji alakoko hybridizes pẹlu awọn RCA ọja ati ki o gbooro, ati awọn rirọpo ti wa ni tẹlẹ owun si awọn RCA ọja The ibosile awọn alakoko fa okun, ki o si tun amplifies ati ki o rirọpo RCA a dendritic ọja.

Awọn anfani ati alailanfani ti sẹsẹ Circle nucleic acid ampilifaya

Awọn anfani ti RCA:

Ifamọ giga, iyasọtọ ti o dara ati iṣẹ irọrun.

Awọn aṣiṣe RCA:

Awọn iṣoro abẹlẹ nigba wiwa ifihan agbara.Lakoko iṣesi RCA, iwadii titiipa ti a ko pin kaakiri ati awoṣe DNA tabi RNA ti iwadii aipin le ṣe ina diẹ ninu awọn ifihan agbara abẹlẹ. 

Nucleicacid ọkọọkan-orisun ampilifaya

Nucleic acid lesese-based amplification (NASBA) jẹ imọ-ẹrọ tuntun ti o dagbasoke lori ipilẹ PCR.O ti wa ni a lemọlemọfún ati isothermal nucleic acid amúṣantóbi ti dari nipasẹ kan bata ti alakoko pẹlu kan T7 olugbeleke ọkọọkan.Imọ-ẹrọ le ṣe alekun awoṣe RNA nipasẹ awọn akoko 109 ni bii awọn wakati 2, eyiti o jẹ awọn akoko 1000 ti o ga ju ọna PCR ti aṣa ati pe ko nilo ohun elo pataki.

A ti lo imọ-ẹrọ yii fun iwadii iyara ti awọn arun ni kete bi o ti han, ati pe ọpọlọpọ awọn ile-iṣẹ lo lọwọlọwọ lọwọlọwọ ni awọn ohun elo wiwa RNA.

Botilẹjẹpe ampilifaya RNA tun le lo imọ-ẹrọ PCR transcription yiyipada, NASBA ni awọn anfani tirẹ: o le ṣee ṣe labẹ awọn ipo iwọn otutu igbagbogbo, ati pe o jẹ iduroṣinṣin ati deede ju imọ-ẹrọ PCR ibile lọ.

Idahun naa wa ni iwọn 41 Celsius ati pe o nilo AMV (ọlọjẹ myeloblastosis avian) yiyipada transcriptase, RNase H, T7 RNA polymerase ati awọn alakoko meji lati pari.

Ilana naa ni akọkọ pẹlu:

Alakoko iwaju ni itọsẹ tobaramu ti olupolowo T7.Lakoko ifarabalẹ, alakoko iwaju sopọ mọ okun RNA ati pe o jẹ itusilẹ nipasẹ enzymu AMV lati ṣe agbekalẹ okun meji DNA-RNA kan.

RNase H n da RNA jẹ ninu okun ilọpo meji arabara ati pe o da DNA ti o ni okun kan duro.

Labẹ iṣẹ ti alakoko iyipada ati enzymu AMV, okun meji DNA kan ti o ni ọna olupolowo T7 ti wa ni akoso.

Labẹ iṣe ti T7 RNA polymerase, ilana igbasilẹ ti pari ati pe iye nla ti RNA ibi-afẹde ti ṣejade.

Awọn anfani ti NASBA:

(1) Awọn oniwe-alakoko ni o ni a T7 olugbeleke ọkọọkan, ṣugbọn awọn ajeji ni ilopo-stranded DNA ni ko si T7 olugbeleke ọkọọkan ati ki o ko ba le wa ni amúṣantóbi ti, ki yi ọna ẹrọ ni ga pato ati ifamọ.

(2) NASBA taara ṣafikun ilana iṣipopada iyipada sinu iṣesi imudara, kikuru akoko ifasilẹ.

Awọn alailanfani ti NASBA:

(1) Awọn paati ifaseyin jẹ idiju diẹ sii.

(2) Awọn oriṣi mẹta ti awọn enzymu ni a nilo lati jẹ ki ifasẹyin naa ga.