PCR, ọpọ PCR, Ni ipo PCR, Yiyipada PCR, RT-PCR, qPCR (1)–PCR

A yoo to awọn ero, awọn igbesẹ ati awọn alaye ti awọn orisirisi PCR

Ⅰ. PCR

Idahun Pq Polymerase, ti a tọka si bi PCR, jẹ imọ-ẹrọ imọ-jinlẹ molikula ti a lo lati tobi si awọn ajẹkù DNA kan pato.O le ṣe akiyesi bi ẹda DNA pataki ni fitiro.DNA polymerase (DNA Polymerase I) ni a ṣe awari ni ibẹrẹ bi 1955, ati Klenow Fragment of E. Coli, eyiti o ni iye idanwo ati ilowo, ti ṣe awari nipasẹ Dokita H. Klenow ni ibẹrẹ awọn ọdun 1970, ṣugbọn nitori pe enzymu yii ko fi aaye gba iwọn otutu, iwọn otutu ti o ga le dinku rẹ, nitorina ko ni ibamu pẹlu iwọn otutu degeneration pq polymerase.Awọn enzymu ti a lo loni (ti a npe ni Taq polymerase), ni a ya sọtọ lati Thermus aquaticus, kokoro arun orisun omi ti o gbona ni 1976. Iwa rẹ ni pe o le koju iwọn otutu giga ati pe o jẹ enzymu ti o dara julọ, ṣugbọn o jẹ lilo pupọ lẹhin awọn 1980.Agbekale atilẹba ti ipilẹṣẹ atilẹba ti PCR jẹ iru si atunṣe pupọ ati didaakọ, eyiti Dokita KJell Kleppe dabaa ni ọdun 1971. O ṣe atẹjade ẹda ẹda akọkọ ti o rọrun ati kukuru-akoko (bii awọn aati meji akọkọ ti PCR).PCR ti o ni idagbasoke loni ni idagbasoke nipasẹ Dokita Kary B. Mullis ni 1983. Dokita Mullis ṣe iranṣẹ awọn ile-iṣẹ PE ni ọdun yẹn, nitorina PE ni ipo pataki ni ile-iṣẹ PCR.Dokita Mullis ṣe agbejade iwe akọkọ ti o ni ibatan pẹlu Saiki ati awọn miiran ni 1985. Lati igbanna, lilo PCR jẹ ẹgbẹẹgbẹrun awọn maili ni ọjọ kan, ati pe didara awọn iwe ti o jọmọ ni a le sọ pe o jẹ ki ọpọlọpọ awọn ọna iwadii miiran jẹ alaiwu.Lẹhinna, imọ-ẹrọ PCR jẹ lilo pupọ ni iwadii imọ-jinlẹ ti ẹkọ ati awọn ohun elo ile-iwosan, di imọ-ẹrọ pataki julọ ti iwadii isedale molikula.Mullis tun gba Ebun Nobel ninu Kemistri ni ọdun 1993.

PCRIlana

Ilana ipilẹ ti imọ-ẹrọ PCR jẹ iru si ilana ẹda ẹda ti DNA, ati pe pato rẹ da lori alakoko oligonucleotide ti o jẹ ibamu si awọn opin mejeeji ti ọkọọkan ibi-afẹde.PCR jẹ ti degeneration-annealing-extending meta ipilẹ awọn igbesẹ: ①Degeneration of template DNA: Lẹhin ti DNA awoṣe ti wa ni kikan si nipa 93°C fun akoko kan, ojutu DNA meji fun awọn meji-pq DNA akoso nipasẹ awọn PCR amúṣantóbi ti awọn awoṣe DNA Nlọ, ṣe awọn ti o kan nikan pq fun awọn ifilelẹ ti awọn esi ti o le wa ni idapo pelu awọn ti o tẹle.②Annealing (compound) ti awoṣe DNA ati alakoko: Lẹhin ti DNA awoṣe ti wa ni kikan ati ti bajẹ sinu ẹwọn kan, iwọn otutu yoo lọ silẹ si iwọn 55°C.Ọkọọkan tobaramu ti alakoko ati awoṣe DNA ẹyọkan.③ Ifaagun ti alakoko: Awoṣe DNA-isopọ alakoko da lori iṣe ti TaqDNA polymerase, pẹlu dNTP gẹgẹbi ohun elo aise.Jeki awọn opo ti ẹda, synthesize titun kan ologbele-ni ipamọ daakọ pq ti o iranlowo awọn awoṣe DNA pq, ki o si tun ọmọ degeneration-annealing-itẹsiwaju mẹta lakọkọ le gba diẹ sii "ologbele-ni ipamọ daakọ pq", ati yi titun pq wa lẹẹkansi Di awoṣe fun awọn nigbamii ti ọmọ.Yoo gba to iṣẹju 2-4 lati pari lupu, jiini ibi-afẹde le pọ si ni ọpọlọpọ awọn akoko miliọnu ni awọn wakati 2-3.

StandardPCRifaseyin System

Marun eroja ti PCR lenu

Ni pataki awọn nkan marun ti o ni ipa ninu iṣesi PCR, eyun alakoko, enzymu, dNTP, awoṣe ati ifipamọ (Mg2+ nilo).[Ilana PCR]

Ilana PCR boṣewa ti pin si awọn igbesẹ mẹta

1. DNA degeneration (90 ° C-96 ° C): Awọn awoṣe DNA meji-pq labẹ iṣẹ igbona, awọn ifunmọ hydrogen fọ, ti o ṣẹda DNA pq kan.

2. Annealing (25 ℃ -65 ℃): Awọn iwọn otutu eto ti wa ni dinku, awọn alakoko ti wa ni idapo pelu DNA awoṣe lati fẹlẹfẹlẹ kan ti agbegbe meji-pq.

3. Itẹsiwaju (70 ℃ -75 ℃): Labẹ awọn iṣẹ ti Taq henensiamu (nipa 72 ° C, ti o dara ju aṣayan iṣẹ-ṣiṣe), dNTP ti wa ni lo bi awọn aise awọn ohun elo ti, fa lati 5 ′ opin alakoko → 3′ opin, kolaginni ati awoṣe iranlowo kọọkan miiran pq DNA.

Yiyika kọọkan jẹ denatured, annealed ati gbooro sii, ni ilọpo meji akoonu DNA.Ni bayi, nitori agbegbe ampilifaya kukuru, diẹ ninu awọn PCR le ṣe atunṣe ni akoko kukuru pupọ paapaa ti iṣẹ-ṣiṣe enzyme Taq ko ba dara julọ, nitorinaa o le yipada si awọn igbesẹ meji, iyẹn ni, annealing ati itẹsiwaju le ṣee ṣe ni 60 ° C-65 ° C ni akoko kanna.Lati le dinku ilana ti gbigbe ati itutu agbaiye ati ilọsiwaju iyara esi.

PCR Reaction awọn ẹya ara ẹrọ

● Giga-Pato

Awọn ifosiwewe ipinnu pato ti idahun PCR jẹ: ①Apapọ kan pato ti alakoko ati DNA awoṣe.② Ilana ti sisọpọ ipilẹ.③ Iduroṣinṣin ti iṣesi iṣelọpọ polymerase TaqDNA.④ Awọn pato ati Konsafetifu ti jiini afojusun.

Ijọpọ ti o tọ ti awọn alakoko ati awọn awoṣe jẹ bọtini.Asopọmọra ti alakoko ati awoṣe ati itẹsiwaju ti pq alakoko da lori ipilẹ ipilẹ ipilẹ ipilẹ.Awọn iṣootọ ti awọn aati iṣelọpọ polymerase ati iwọn otutu giga ti Taq DNA polymerase lati ṣe abuda (compound) ti awoṣe ati alakoko ninu iṣesi le ṣee ṣe ni iwọn otutu ti o ga julọ.Awọn pato ti awọn apapo ti wa ni gidigidi pọ.Agekuru le ṣetọju iwọn giga ti atunse.Nipa yiyan agbegbe jiini ibi-afẹde kan pẹlu Konsafetifu giga ati Konsafetifu giga, iyasọtọ rẹ ga julọ.

● Ifamọ giga

Iwọn iṣelọpọ ti awọn ọja PCR pọ si nipasẹ atọka, eyiti o le faagun awoṣe ibẹrẹ ti Picker (PG=10-12) lati mu ipele microcontroller pọ si ipele ti awọn micrograms (μg= -6).Awọn sẹẹli ibi-afẹde le ṣee wa-ri lati awọn sẹẹli miliọnu kan;ni wiwa ti awọn ọlọjẹ, ifamọ ti PCR le de ọdọ 3 RFU (awọn aaye ti o ṣofo ti a ṣẹda awọn iwọn);Iwọn wiwa ti o kere julọ ni imọ-jinlẹ kokoro jẹ kokoro arun 3.

● Rọrun ati Yara

Iṣafihan PCR naa nlo Taq DNA polymerase ti o ni iwọn otutu ti o ga, eyiti o ṣe afikun ojutu ifasẹyin ni akoko kan, iyẹn ni, ifaagun degeneration-anneal-itẹsiwaju lori ojutu imudara DNA ati ikoko iwẹ omi.Ni gbogbogbo, imudara imudara ti pari ni awọn wakati 2 si 4.Awọn ọja ti a ṣe afikun ni a ṣe atupale gbogbogbo nipasẹ idà itanna, ati pe ko ni lati lo awọn isotopes, ko si idoti ipanilara, ati igbega irọrun.

● Mimọ ti apẹrẹ jẹ kekere

Ko si iwulo lati ya awọn ọlọjẹ tabi kokoro arun ati awọn sẹẹli aṣa.Awọn ọja robi DNA ati RNA le ṣee lo bi awọn amplifiers.Wiwa imudara DNA le ṣee lo taara ni lilo awọn apẹẹrẹ ile-iwosan gẹgẹbi ẹjẹ, omi ara, omi fifọ Ikọaláìdúró, irun, awọn sẹẹli, ati àsopọ alãye.

PCRwọpọ isoro

● Odi eke, ko si awọn ohun elo ti o pọ si

Awọn ipele bọtini ti iṣesi PCR pẹlu: ① igbaradi ti awọn acids nucleic awoṣe, ② didara ati pato ti awọn alakoko, ③ didara awọn enzymu ④ Awọn ipo iwọn PCR.Wiwa idi naa yẹ ki o tun ṣe atupale ati iwadi fun awọn ọna asopọ loke.

Awọn awoṣe: ① Awoṣe naa ni amuaradagba oniruuru, ② Awoṣe naa ni inhibitor enzymu Taq kan, ③ Awọn amuaradagba inu awoṣe ko jẹ imukuro, paapaa amuaradagba ẹgbẹ ninu chromosome.⑤ Deminer nucleic acid degeneration ko ni kikun.Nigbati didara awọn enzymu ati awọn alakoko ba dara, ko si ẹgbẹ ampilifaya, eyiti o ṣee ṣe julọ itọju ounjẹ ti awọn apẹẹrẹ.Nkankan wa ti ko tọ pẹlu ilana isediwon acid nucleic, nitorinaa lati ṣeto ojutu tito nkan lẹsẹsẹ ati iduroṣinṣin, ilana rẹ yẹ ki o wa titi ati pe ko yipada lainidii.

Aiṣiṣẹ enzymu: enzymu tuntun tabi mejeeji atijọ ati awọn enzymu tuntun yẹ ki o lo papọ lati ṣe itupalẹ boya iṣẹ ṣiṣe enzymu ti sọnu tabi ko to, ti o yori si awọn odi eke.O yẹ ki o ṣe akiyesi pe Taq henensiamu tabi ethidium bromide jẹ igbagbe nigbakan.

Alakoko: didara ti alakoko, ifọkansi ti alakoko, ati boya ifọkansi ti awọn alakoko meji jẹ iṣiro.O jẹ idi ti o wọpọ fun ikuna PCR tabi ẹgbẹ ti o pọ si kii ṣe apẹrẹ ati itara lati tan kaakiri.Awọn iṣoro wa pẹlu didara awọn alakoko diẹ ninu awọn nọmba ipele.Awọn alakoko meji ni ifọkansi giga ati ifọkansi kekere, ti o nfa imudara asymmetric kekere-ṣiṣe.Awọn wiwọn atako ni: ① Yan alakoko to dara lati mu awọn ẹyọ pọ.② Ifojusi ti alakoko ko da lori iye OD nikan, ṣugbọn tun san ifojusi si omi atilẹba ti alakoko lati ṣe agar suga gel electrophoresis.Agbegbe rinhoho alakoko gbọdọ wa, ati imọlẹ awọn alakoko meji yẹ ki o wa ni deede.Igbanu, PCR le kuna ni akoko yii, ati pe o yẹ ki o yanju pẹlu ẹyọ iṣelọpọ alakoko.Ti alakoko ba ga, imọlẹ naa dinku, ati pe ifọkansi rẹ gbọdọ jẹ iwọntunwọnsi nigbati o ba fomi po.③ Awọn alakoko yẹ ki o san ati ki o tọju ni ibi ifọkansi giga lati ṣe idiwọ didi pupọ tabi awọn ẹya igba otutu igba pipẹ ti firiji, eyiti yoo fa alakoko lati bajẹ ati dinku.④ Awọn apẹrẹ ti alakoko jẹ aiṣedeede, gẹgẹbi ipari ti alakoko ko to, ati pe iṣupọ ti wa ni akoso laarin awọn alakoko.

Mg2 + ifọkansi: Idojukọ Mg2 + ion ni ipa nla lori ṣiṣe imudara PCR.Idojukọ ti o pọju le dinku ibalopo idakeji ti PCR ampilifaya.Ti ifọkansi ba kere ju, iṣelọpọ imudara PCR yoo paapaa jẹ ki ikuna imudara PCR laisi ẹgbẹ imugboroja.

Iyipada iwọn didun lenu: Iwọn ti a lo ninu imudara PCR jẹ 20ul, 30ul, ati 50ul tabi 100uL, iwọn nla ti ohun elo fun imudara PCR ti ṣeto ni ibamu si awọn idi oriṣiriṣi ti iwadii imọ-jinlẹ ati idanwo ile-iwosan.Lẹhin ṣiṣe awọn iwọn kekere bi 20ul, o jẹ dandan lati ṣe ipo okun nigba ṣiṣe iwọn, bibẹkọ ti yoo kuna.

Awọn idi ti ara: Iyipada jẹ pataki pupọ fun imudara PCR.Ti iwọn otutu degeneration ba wa ni kekere, akoko ibajẹ jẹ kukuru, o ṣee ṣe lati waye ni awọn odi eke;iwọn otutu annealing ti o lọ silẹ le fa imudara ti kii ṣe pato ati dinku ṣiṣe imudara kan pato.Giga ni ipa lori apapọ awọn alakoko ati awọn awoṣe lati dinku ṣiṣe imudara PCR.Nigba miiran o jẹ dandan lati lo awọn iwọn otutu ti o yẹ lati wa iyatọ, annealing ati iwọn otutu ti o gbooro sii ni itẹsiwaju tabi omi-oṣuwọn omi, eyiti o jẹ ọkan ninu awọn idi fun ikuna ti PCR.

Awọn iyatọ ọkọọkan ibi-afẹde: Ti ilana ibi-afẹde ba waye, iyipada tabi piparẹ, apapọ apẹrẹ ati awoṣe naa ni idapo, tabi nitori aini ti ọkọọkan ibi-afẹde, alakoko ati awoṣe yoo padanu ilana ibaramu, ati imudara PCR rẹ kii yoo ṣaṣeyọri.

● Irọ́ òdì

Ẹgbẹ ampilifaya PCR han ni ibamu pẹlu ẹgbẹ ọkọọkan ibi-afẹde, ati nigba miiran ẹgbẹ rẹ jẹ afinju ati giga julọ.

Apẹrẹ alakoko ko yẹ: ọkọọkan imudara ti a yan ati ọkọọkan imudara ti kii ṣe idi ni isokan, nitorinaa nigbati imudara PCR, awọn ọja PCR ti o pọ si jẹ awọn ilana ti ko ni idi.Ọkọọkan ibi-afẹde ti kuru ju tabi alakoko ti kuru ju, ati pe o ni itara si rere eke.Nilo lati tun ṣe.

Agbelebu idoti ti ibi-afẹde ọkọọkan tabi awọn ọja imudara: Awọn idi meji lo wa fun idoti yii: Ni akọkọ, idoti agbelebu ti gbogbo genome tabi awọn abala nla, ti o yori si awọn idaniloju eke.Iru idaniloju iro yii le ṣee yanju nipasẹ awọn ọna wọnyi: Ṣọra ati jẹjẹ lakoko iṣẹ lati ṣe idiwọ ọkọọkan ibi-afẹde lati fa simu sinu ibon ayẹwo tabi asesejade kuro ninu tube centrifugal.Ayafi fun awọn enzymu ati awọn nkan ti ko le duro ni awọn iwọn otutu giga, gbogbo awọn reagents tabi ohun elo yẹ ki o jẹ disinfected pẹlu titẹ giga.Awọn paipu centrifugal ati awọn ayẹwo yẹ ki o lo ni akoko kan.Nigbati o ba jẹ dandan, ṣaaju fifi awọn apẹẹrẹ kun, tube ifaseyin ati reagent ti han si awọn egungun ultraviolet lati pa acid nucleic ti o wa tẹlẹ run.Keji, awọn ajẹkù kekere ni idoti afẹfẹ.Awọn ajẹkù kekere wọnyi kuru ju ọna ibi-afẹde lọ, ṣugbọn wọn ni isomọ kan.O le wa ni spliced ​​pẹlu kọọkan miiran.Lẹhin ti o ṣe afikun awọn alakoko, ọja PCR le pọ si, eyiti yoo fa iṣelọpọ rere eke.O le ṣee lo lati dinku tabi imukuro ọna PCR itẹ-ẹiyẹ.

● Ṣe afihan ẹgbẹ imudara ti kii ṣe pato

Awọn ẹgbẹ ti o han lẹhin imudara PCR ko ni ibamu pẹlu iwọn ti a reti, tabi nla tabi kekere, tabi ni akoko kanna, tabi ni akoko kanna, awọn ẹgbẹ imudara kan pato ati awọn ẹgbẹ imudara ti kii ṣe pato.Ifarahan ti awọn ẹgbẹ ti kii ṣe pato ni: Ni akọkọ, awọn alakoko ko pe ni ibamu si ọna ibi-afẹde, tabi polymerization ti alakoko lati ṣe iṣupọ kan.Awọn keji ni wipe awọn ifọkansi ti MG2 + ions jẹ ga ju, awọn annealing otutu ti wa ni kekere ju, ati awọn nọmba ti PCR cycles ni ibatan.Ni ẹẹkeji, didara ati iye awọn enzymu.Nigbagbogbo, awọn enzymu ti diẹ ninu awọn orisun jẹ itara si awọn ẹgbẹ ti kii ṣe pataki ati awọn enzymu ti orisun miiran ko waye.Nigba miiran iṣamulo ti kii ṣe pato ti awọn enzymu tun waye.Awọn ọna wiwọn jẹ: tun ṣe apẹrẹ awọn ifamọra ti o ba jẹ dandan.Din iye henensiamu dinku tabi rọpo enzymu ti orisun miiran.Din iye ti akọkọ dinku, mu iye awọn awoṣe pọ si daradara, ati dinku nọmba awọn iyipo.Mu iwọn otutu annealing pọ daradara tabi lo ọna aaye iwọn otutu meji (93°C degeneration, annealing and extending at about 65°C).

● Ṣe afihan fifa fifa tabi teepu smear

PCR ampilifaya ma han lati wa ni loo tabi shelled tabi capeti-like igbanu.Fun idi naa, nitori iye pupọ ti awọn enzymu tabi didara ko dara ti henensiamu, ifọkansi dNTP ga ju, ifọkansi Mg2+ ga ju, iwọn otutu annealing ti lọ silẹ pupọ, ati pe nọmba awọn iyipo ti pọ ju.Awọn wiwọn atako ni: ①Dinku iye awọn enzymu, tabi yi enzymu ti orisun miiran pada.② Din ifọkansi ti dNTP dinku ③Dinku ifọkansi Mg2+ daradara.④ Ṣe alekun opoiye awọn awoṣe ki o dinku nọmba awọn iyipo.

Jẹmọ Products

Akikanju PCR (Pẹlu Dye)

◮ Iduroṣinṣin ti o ga julọ: Awọn akoko 6 ti itanna Taq lasan;

◮ Iyara ampilifaya yiyara

◮ Iyipada awoṣe diẹ sii

◮ Imudara imudara ti o ga julọ

Ifarada ayika ni okun sii: gbe ni 37 ° C fun ọsẹ kan, mimu diẹ sii ju 90% iṣẹ;

◮ O ni 5'→ 3' iṣẹ DNA polymerase ati 5'→ 3' iṣẹ exonuclease, laisi iṣẹ-ṣiṣe 3'→ 5' exonuclease.

PCR Easyᵀᴹ (Pẹlu Dye)

Eto ifasilẹ alailẹgbẹ ati ṣiṣe giga Taq DNA Polymerase jẹ ki iṣe PCR ni ṣiṣe imudara ti o ga julọ, pato ati ifamọ.

RT-qPCR Easyᵀᴹ (Igbese Kan) -SYBR Green I

Ohun elo-igbesẹ kan jẹ ki transcription yiyipada ati qPCR awọn aati meji ni tube kanna, nikan nilo lati ṣafikun awoṣe RNA, awọn alakoko PCR kan pato ati RNase-ọfẹ ddH₂O.

◮ Ohun elo naa le yara ati daradara ni iwọn ṣe itupalẹ RNA gbogun ti tabi wa kakiri RNA.

◮ Ohun elo naa nlo reagent iyipada iyipada Foregene alailẹgbẹ ati Foregene HotStar Taq DNA Polymerase ni idapo pẹlu eto ifalọ alailẹgbẹ lati mu imunadoko imudara imudara ati pato ifesi.

◮ Eto imudara iṣapeye jẹ ki iṣesi naa ni ifamọra wiwa ti o ga, iduroṣinṣin igbona ti o lagbara, ati ifarada to dara julọ.

Rọrun RT-qPCR^TM(Igbese kan) -SYBR Green I kit wa pẹlu ROX ti abẹnu itọkasi dye, eyi ti o le ṣee lo lati se imukuro isale ifihan ati awọn aṣiṣe ifihan agbara laarin awọn kanga, eyi ti o jẹ rọrun fun awọn onibara lati lo ni orisirisi awọn awoṣe ti pipo PCR irinṣẹ.

RT Rọrun^TMII (Titunto Premix fun okun-akọkọ cDNA kolaginni funPCR akoko gidi)

-Agbara daradara lati yọ gDNA kuro, eyiti o le yọ gDNA kuro ninu awoṣe laarin awọn iṣẹju 2.

-Eto iyipada iyipada ti o munadoko, o gba iṣẹju 15 nikan lati pari iṣelọpọ ti cDNA okun akọkọ.

- Awọn awoṣe eka: awọn awoṣe pẹlu akoonu GC giga ati eto ile-ẹkọ giga ti eka le tun yipada pẹlu ṣiṣe giga.

-Eto ifamọ yiyipada ọna kika, awọn awoṣe pg-ipele tun le gba cDNA didara ga.

-Eto transcription yiyipada ni iduroṣinṣin igbona giga, iwọn otutu ti o dara julọ jẹ 42 ℃, ati pe o tun ni iṣẹ iṣipopada ti o dara ni 50℃.