PCR (idahun pq polymerase) jẹ ọkan ninu awọn imọ-ẹrọ imudara DNA inu-fitiro, pẹlu itan-akọọlẹ ti o ju ọgbọn ọdun lọ.

Imọ-ẹrọ PCR jẹ aṣáájú-ọnà nipasẹ Kary Mullis ti Cetus, AMẸRIKA ni ọdun 1983. Mullis beere fun itọsi PCR ni 1985 o si ṣe atẹjade iwe ẹkọ PCR akọkọ lori Imọ ni ọdun kanna.Mullis gba Ebun Nobel ninu kemistri ni ọdun 1993 fun iṣẹ rẹ.

Awọn ilana ipilẹ ti PCR

PCR le ṣe alekun awọn ajeku DNA ibi-afẹde nipasẹ diẹ sii ju awọn akoko miliọnu kan lọ.Ilana naa wa labẹ catalysis ti DNA polymerase, lilo DNA okun obi bi awoṣe ati alakoko kan pato bi aaye ibẹrẹ fun itẹsiwaju.O jẹ atunṣe ni fitiro nipasẹ awọn igbesẹ bii denaturation, annealing, ati itẹsiwaju.Ilana ti okun ọmọbinrin DNA tobaramu si awọn obi okun awoṣe DNA.

Ilana PCR boṣewa ti pin si awọn igbesẹ mẹta:

1.Denaturation: Lo iwọn otutu giga lati ya awọn okun meji DNA lọtọ.Isopọ hydrogen laarin awọn okun meji DNA ti bajẹ ni iwọn otutu giga (93-98 ℃).

2.Annealing: Lẹhin ti DNA ti o ni ilọpo meji ti yapa, dinku iwọn otutu ki alakoko le so mọ DNA ti o ni ẹyọkan.

3.Extension: DNA polymerase bẹrẹ lati ṣajọpọ awọn okun ibaramu pẹlu awọn okun DNA lati awọn alakoko ti a dè nigbati iwọn otutu ba dinku.Nigbati itẹsiwaju ba ti pari, iyipo kan ti pari, ati nọmba awọn ajẹkù DNA ni ilọpo meji

Ni atunṣe awọn igbesẹ mẹta wọnyi ni igba 25-35, nọmba awọn ajẹkù DNA yoo pọ si ni afikun.

Ọgbọn ti PCR ni pe awọn alakoko oriṣiriṣi le ṣe apẹrẹ fun oriṣiriṣi awọn jiini ibi-afẹde, ki awọn ajẹki apilẹṣẹ ibi-afẹde le jẹ alekun ni igba diẹ.

Lọwọlọwọ, PCR le pin si awọn ẹka mẹta, eyun PCR lasan, PCR pipo fluorescent ati PCR oni-nọmba.

Ni igba akọkọ ti iran ti arinrin PCR

Lo ohun elo imudara PCR lasan lati mu jiini ibi-afẹde pọ si, lẹhinna lo agarose gel electrophoresis lati ṣawari ọja naa, itupalẹ agbara nikan le ṣee ṣe.

Awọn aila-nfani akọkọ ti PCR iran akọkọ:

1.Prone si imudara ti kii ṣe pato ati awọn esi rere eke.

2.The erin gba igba pipẹ ati awọn isẹ ti jẹ cumbersome.

3.Only qualitative test le ṣee ṣe

Ẹlẹẹkeji-akoko Real-Time PCR

PCR-akoko gidi, ti a tun mọ ni qPCR, nlo awọn iwadii fluorescent ti o le ṣe afihan ilọsiwaju ti eto ifaseyin, ati ṣe abojuto ikojọpọ awọn ọja ti o pọ si nipasẹ ikojọpọ awọn ifihan agbara fluorescent, ati ṣe idajọ awọn abajade nipasẹ iṣiṣan fluorescence.O le ṣe iwọn pẹlu iranlọwọ ti iye Cq ati ti tẹ boṣewa.

Nitoripe imọ-ẹrọ qPCR ni a ṣe ni eto pipade, iṣeeṣe ti ibajẹ ti dinku, ati pe ifihan agbara fluorescence le ṣe abojuto fun wiwa titobi, nitorinaa o jẹ lilo pupọ julọ ni adaṣe ile-iwosan ati pe o ti di imọ-ẹrọ ti o ga julọ ni PCR.

Awọn oludoti Fuluorisenti ti a lo ninu PCR pipo Fuluorisenti gidi-gidi ni a le pin si: Iwadi fluorescent TaqMan, awọn beakoni molikula ati awọ fluorescent.

1) Iwadi fluorescent TaqMan:

Lakoko imudara PCR, iwadii fluorescent kan pato ni a ṣafikun lakoko fifi bata alakoko kan kun.Iwadii jẹ oligonucleotide, ati awọn opin mejeeji ni aami pẹlu ẹgbẹ fluorescent onirohin ati ẹgbẹ fluorescent quencher.

Nigbati iwadii ba wa ni mule, ifihan Fuluorisenti ti o jade nipasẹ ẹgbẹ onirohin ti gba nipasẹ ẹgbẹ quenching;nigba PCR ampilifaya, awọn 5'-3' exonuclease aṣayan iṣẹ-ṣiṣe ti Taq henensiamu cleaves ati degrades awọn iwadi, ṣiṣe awọn onirohin Fuluorisenti ẹgbẹ ati quencher Ẹgbẹ Fuluorisenti ti yapa, ki awọn fluorescence monitoring eto le gba awọn fluorescence ifihan agbara, ti o ni, ni gbogbo igba ti a okun DNA ti wa ni amúṣantóbi ti, a fluorescent ifihan agbara ti wa ni akoso patapata ati fluorescent ifihan agbara. pẹlu awọn Ibiyi ti PCR ọja.

2) Dye Fuluorisenti SYBR:

Ninu eto ifasilẹ PCR, iyọkuro ti awọ Fuluorisenti SYBR ti wa ni afikun.Lẹhin ti SYBR Fuluorisenti dye ti wa ni ti kii-ni pato dapọ si DNA ni ilopo-okun, o njade lara ifihan Fuluorisenti.Molikula dye SYBR ti ko dapọ si pq kii yoo ṣe itusilẹ eyikeyi ifihan agbara Fuluorisenti, nitorinaa aridaju ifihan agbara Fuluorisenti Ilọsoke ninu awọn ọja PCR jẹ mimuuṣiṣẹpọ patapata pẹlu ilosoke ninu awọn ọja PCR.SYBR nikan sopọ mọ DNA ti o ni ilopo-meji, nitorinaa iyipo yo le ṣee lo lati pinnu boya iṣesi PCR jẹ pato.

3) Imọlẹ Molecular:

O jẹ itọka oligonucleotide ti o ni aami-meji ti o ni itọka ti stem-loop ti o ṣe apẹrẹ irun ti o fẹrẹ to awọn ipilẹ 8 ni awọn opin 5 ati 3.Awọn itọsẹ acid nucleic ni awọn opin mejeeji ni a so pọ ni ibamu, ti o nfa ki ẹgbẹ Fuluorisenti ati ẹgbẹ quenching naa ṣinṣin.Sunmọ, ko si fluorescence yoo ṣe jade.

Lẹhin ti ọja PCR ti ṣe ipilẹṣẹ, lakoko ilana isọdọkan, apakan aarin ti beakoni molikula ni a so pọ pẹlu ọkọọkan DNA kan pato, ati pe jiini Fuluorisenti ti yapa kuro ninu apilẹṣẹ quencher lati gbejade fluorescence.

Awọn aila-nfani akọkọ ti PCR-keji:

Ifamọ ṣi ṣi, ati wiwa ti awọn apẹẹrẹ ẹda-kekere ko pe.

Ipa ti iye ẹhin wa, ati abajade jẹ ifaragba si kikọlu.

Nigbati awọn inhibitors PCR wa ninu eto ifaseyin, awọn abajade wiwa ni ifaragba si kikọlu.

Kẹta iran oni PCR

PCR oni-nọmba (DigitalPCR, dPCR, Dig-PCR) ṣe iṣiro nọmba ẹda ti ọkọọkan ibi-afẹde nipasẹ wiwa ipari-ojuami, ati pe o le ṣe wiwa wiwa pipo deede laisi lilo awọn iṣakoso inu ati awọn ilọpa boṣewa.

PCR oni-nọmba nlo wiwa-ojuami ipari ati pe ko dale lori iye Ct (alapade ọmọ), nitorinaa iṣesi PCR oni-nọmba ko ni ipa nipasẹ ṣiṣe imudara, ati ifarada si awọn inhibitors aati PCR ti ni ilọsiwaju, pẹlu iṣedede giga ati atunṣe.

Nitori awọn abuda ti ifamọ giga ati iṣedede giga, ko ni irọrun ni irọrun nipasẹ awọn inhibitors ifaseyin PCR, ati pe o le ṣaṣeyọri iwọn pipe otitọ laisi awọn ọja boṣewa, eyiti o ti di aaye iwadii ati ohun elo.

Gẹgẹbi awọn ọna oriṣiriṣi ti ẹya ifaseyin, o le pin si awọn oriṣi akọkọ mẹta: microfluidic, chirún ati awọn eto droplet.

1) PCR oni-nọmba Microfluidic, mdPCR:

Da lori imọ-ẹrọ microfluidic, awoṣe DNA ti yapa.Imọ-ẹrọ microfluidic le ṣe akiyesi iṣagbega nano-igbega ayẹwo tabi iran ti awọn isunmi kekere, ṣugbọn awọn droplets nilo ọna adsorption pataki kan lẹhinna ni idapo pẹlu eto ifura PCR.mdPCR ti di diẹdiẹ nipasẹ awọn ọna miiran rọpo.

2) PCR oni-nọmba ti o da silẹ, ddPCR:

Lo imọ-ẹrọ iran droplet omi-ni-epo lati ṣe ilana ayẹwo sinu awọn droplets, ati pin eto ifaseyin ti o ni awọn ohun elo acid nucleic sinu ẹgbẹẹgbẹrun awọn droplets nanoscale, ọkọọkan eyiti ko ni moleku ibi-afẹde nucleic acid lati wa-ri, tabi Ni ọkan si ọpọlọpọ awọn ohun elo ibi-afẹde nucleic acid lati ṣe idanwo.

3) PCR oni-nọmba ti Chip, cdPCR:

Lo imọ-ẹrọ ọna ito ti irẹpọ lati kọ ọpọlọpọ awọn microtubes ati awọn microcavities lori awọn wafers ohun alumọni tabi gilaasi kuotisi, ati ṣakoso sisan ti ojutu nipasẹ awọn falifu iṣakoso oriṣiriṣi, ati pin omi ayẹwo sinu awọn nanometers ti iwọn kanna sinu awọn kanga esi fun Idahun PCR oni-nọmba lati ṣaṣeyọri iwọn pipe.

Awọn aila-nfani akọkọ ti PCR iran kẹta:

Awọn ohun elo ati awọn reagents jẹ gbowolori.

Awọn ibeere didara awoṣe jẹ giga.Ti opoiye awoṣe ba kọja opoiye microsystem, kii yoo ṣee ṣe lati ṣe iwọn, ati pe ti o ba kere ju, deede iwọn yoo dinku.

Awọn idaniloju eke tun le ṣe ipilẹṣẹ nigba ti kii ṣe iyasọtọ pato.