RT-qPCR ti ni idagbasoke lati imọ-ẹrọ PCR arinrin.O ṣe afikun awọn kemikali Fuluorisenti (awọn awọ fluorescent tabi awọn iwadii fluorescent) si eto ifarabalẹ PCR ti aṣa, ati ṣe iwari ilana imudara PCR ati ilana itẹsiwaju ni akoko gidi ni ibamu si awọn ọna itanna luminescent oriṣiriṣi wọn.Awọn iyipada ifihan agbara Fuluorisenti ni alabọde ni a lo lati ṣe iṣiro iye iyipada ọja ni ọmọ kọọkan ti PCR.Lọwọlọwọ, awọn ọna ti o wọpọ julọ jẹ ọna awọ Fuluorisenti ati ọna iwadii.

Ọna awọ Fuluorisenti:
Diẹ ninu awọn awọ Fuluorisenti, gẹgẹbi SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ati bẹbẹ lọ, ko ṣe tan ina funrara wọn, ṣugbọn ṣe itujade fluorescence lẹhin ti o so mọ iho kekere ti dsDNA.Nitorinaa, ni ibẹrẹ ti iṣe PCR, ẹrọ naa ko le rii ifihan agbara Fuluorisenti.Nigbati iṣesi ba tẹsiwaju si annealing-itẹsiwaju (ọna igbesẹ meji) tabi ipele itẹsiwaju (ọna igbesẹ mẹta), awọn okun ilọpo meji yoo ṣii ni akoko yii, ati DNA polymerase tuntun Lakoko iṣelọpọ okun, awọn ohun elo fluorescent ti wa ni idapo ni yara kekere dsDNA ati didan fluorescence.Bi nọmba awọn iyika PCR ṣe n pọ si, awọn awọ diẹ sii ati siwaju sii darapọ pẹlu dsDNA, ati ifihan agbara Fuluorisenti tun ni ilọsiwaju nigbagbogbo.Mu SYBR Green Ⅰ gẹgẹbi apẹẹrẹ.
Ọna iwadii:
Iwadii Taqman jẹ iwadii hydrolysis ti o wọpọ julọ.Ẹgbẹ Fuluorisenti kan wa ni opin 5′ ti iwadii naa, nigbagbogbo FAM.Iwadi funrarẹ jẹ itọsẹ ti o ni ibamu si jiini ibi-afẹde.Ẹgbẹ quenching Fuluorisenti wa ni opin 3′ ti fluorophore.Ni ibamu si awọn opo ti Fuluorisenti resonance gbigbe agbara (Förster resonance agbara gbigbe, FRET), nigbati awọn onirohin Fuluorisenti Ẹgbẹ (oluranlọwọ Fuluorisenti moleku) ati awọn quenching Fuluorisenti ẹgbẹ (acceptor Fuluorisenti moleku) Nigba ti awọn excitation julọ.Oniranran ni lqkan ati awọn ijinna jẹ gidigidi sunmo (7-10nm ti awọn excimole) awọn excimole ti awọn excimole ti o le gba awọn excimole molecule. moleku, nigba ti autofluorescence jẹ alailagbara.Nitorinaa, ni ibẹrẹ ti iṣesi PCR, nigbati iwadii ba wa ni ọfẹ ati mule ninu eto naa, ẹgbẹ fluorescent ti onirohin kii yoo tan imọlẹ.Nigbati o ba n parẹ, alakoko ati iwadii naa so mọ awoṣe naa.Lakoko ipele itẹsiwaju, polymerase n ṣepọ awọn ẹwọn tuntun nigbagbogbo.DNA polymerase ni iṣẹ-ṣiṣe 5'-3' exonuclease.Nigbati o ba de iwadi naa, DNA polymerase yoo ṣe hydrolyze iwadi naa lati inu awoṣe, ya ẹgbẹ fluorescent ti onirohin kuro lati ẹgbẹ fluorescent quencher, ki o si tu ifihan agbara fluorescent silẹ.Niwọn igba ti ibatan ọkan-si-ọkan wa laarin iwadii ati awoṣe, ọna iwadii ga julọ si ọna dai ni awọn ofin ti deede ati ifamọ ti idanwo naa.

Aworan 1 Ilana ti qRT-PCR

Apẹrẹ akọkọ
Awọn ilana:

Awọn alakoko yẹ ki o jẹ apẹrẹ ni agbegbe ti a fipamọ ti jara nucleic acid ati ni pato.

O dara julọ lati lo ọna cDNA, ati pe ọna mRNA tun jẹ itẹwọgba.Ti kii ba ṣe bẹ, ṣawari apẹrẹ agbegbe cds ti ọkọọkan DNA.
Gigun ti ọja pipo Fuluorisenti jẹ 80-150bp, gigun julọ jẹ 300bp, ipari alakoko jẹ gbogbogbo laarin awọn ipilẹ 17-25, ati iyatọ laarin oke ati awọn alakoko isalẹ ko yẹ ki o tobi ju.

Akoonu G+C wa laarin 40% ati 60%, ati 45-55% ni o dara julọ.
Iye TM wa laarin awọn iwọn 58-62.
Gbiyanju lati yago fun awọn dimers alakoko ati awọn dimers ti ara ẹni, (ma ṣe han diẹ sii ju awọn orisii 4 ti awọn ipilẹ ibaramu itẹlera) ọna irun irun, ti ko ba ṣee ṣe, ṣe ΔG <4.5kJ / mol * Ti o ko ba le rii daju pe a ti yọ gDNA kuro lakoko transcription yiyipada, o dara julọ lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko ti intron, A ko le yago fun awọn agbegbe * 3 ′ AT ọlọrọ, ko le yago fun GD. eto lemọlemọfún (2-3) awọn alakoko ati ti kii-
ni pato Awọn isomọ ti ọna ti o pọ ni ilopọ ni o dara julọ kere ju 70% tabi ni 8 ibaramu ipilẹ homology.
Ipilẹ data:
CottonFGD wiwa nipasẹ awọn koko
Apẹrẹ akọkọ:
IDT-qPCR alakoko design

Fig2 IDT oju-iwe irinṣẹ apẹrẹ alakoko ori ayelujara

Fig3 ifihan oju-iwe abajade
Apẹrẹ ti awọn alakoko lncRNA:
lncRNA:Awọn igbesẹ kanna bi mRNA.
miRNA:Ilana ti ọna loop stem: Niwọn igba ti gbogbo awọn miRNA jẹ awọn ọna kukuru ti bii 23 NT, wiwa PCR taara ko ṣee ṣe, nitorinaa ohun elo ọkọọkan stem-loop ti lo.Ilana-lupu ti o tẹle jẹ DNA ti o ni ẹyọkan ti o fẹrẹ to 50 nt, eyiti o le ṣe agbekalẹ irun-awọ kan funrararẹ.3 'Ipari naa le ṣe apẹrẹ bi ọna ti o ni ibamu si ajẹkù apa kan miRNA, lẹhinna miRNA ibi-afẹde le ni asopọ si ọkọọkan stem-loop lakoko transcription, ati ipari lapapọ le de 70bp, eyiti o wa ni ila pẹlu ipari ọja imudara ti a pinnu nipasẹ qPCR.Tailing miRNA alakoko apẹrẹ.
Ṣiṣawari-pato:
Aaye data bugbamu bugbamu: CottonFGD bugbamu nipasẹ ibajọra ọkọọkan
Gbigbọn agbegbe: Tọkasi lilo Blast + lati ṣe bugbamu agbegbe, linux ati macos le ṣe agbekalẹ data data agbegbe taara, eto win10 tun le ṣee ṣe lẹhin fifi sori ẹrọ ubuntu bash.Ṣẹda ibi ipamọ data agbegbe ati bugbamu agbegbe;ṣii ubuntu bash lori win10.
Akiyesi: Owu oke ati owu erekusu okun jẹ awọn irugbin tetraploid, nitorinaa abajade bugbamu yoo nigbagbogbo jẹ awọn ere-kere meji tabi diẹ sii.Ni igba atijọ, lilo awọn cds NAU gẹgẹbi ibi ipamọ data lati ṣe bugbamu jẹ seese lati wa awọn jiini isokan meji pẹlu awọn iyatọ SNP diẹ.Nigbagbogbo, awọn Jiini isokan meji ko le ṣe iyatọ nipasẹ apẹrẹ alakoko, nitorinaa wọn ṣe itọju bi kanna.Ti indel ti o han gbangba ba wa, alakoko ni a maa n ṣe apẹrẹ lori indel, ṣugbọn eyi le ja si ọna-atẹle ti alakoko Agbara ọfẹ di ti o ga, ti o yori si idinku ninu ṣiṣe imudara, ṣugbọn eyi ko ṣee ṣe.

Ṣiṣawari ti iṣeto alakọbẹrẹ:
Awọn igbesẹ:ìmọ oligo 7 → awoṣe titẹ sii → sunmọ window window → fipamọ → wa alakoko lori awoṣe, tẹ ctrl + D lati ṣeto ipari alakoko → ṣe itupalẹ awọn oriṣiriṣi awọn ẹya ile-ẹkọ keji, gẹgẹbi ara-dimerization body, heterodimer, hairpin, mismatch, bbl Awọn aworan meji ti o kẹhin ni Figure 4 ni awọn abajade idanwo ti awọn alakoko.Abajade ti alakoko iwaju dara, ko si dimer ti o han gedegbe ati eto irun-awọ, ko si awọn ipilẹ ibaramu ti nlọ lọwọ, ati pe iye pipe ti agbara ọfẹ jẹ kere ju 4.5, lakoko ti alakoko ẹhin fihan lemọlemọfún Awọn ipilẹ 6 jẹ ibaramu, ati agbara ọfẹ jẹ 8.8;ni afikun, dimer to ṣe pataki diẹ sii han ni ipari 3, ati dimer ti awọn ipilẹ itẹlera 4 han.Botilẹjẹpe agbara ọfẹ ko ga, 3′ dimer Chl le ṣe pataki ni pato imudara ati imudara imudara.Ni afikun, o jẹ dandan lati ṣayẹwo fun awọn irun irun, heterodimers, ati awọn aiṣedeede.

Fig3 oligo7 erin esi
Ṣiṣawari imudara imudara:
Imudara imudara ti iṣe PCR ṣe pataki ni ipa lori awọn abajade PCR.Paapaa ni qRT-PCR, imudara imudara jẹ pataki pataki fun awọn abajade iwọn.Yọ awọn oludoti miiran kuro, awọn ẹrọ ati awọn ilana ni ifipamọ ifura.Didara awọn alakoko tun ni ipa nla lori imudara imudara ti qRT-PCR.Lati le rii daju deede ti awọn abajade, mejeeji iwọn fluorescence ojulumo ati iwọn fluorescence pipe nilo lati rii ṣiṣe imudara ti awọn alakoko.O jẹ akiyesi pe ṣiṣe imudara qRT-PCR ti o munadoko wa laarin 85% ati 115%.Awọn ọna meji wa:
1. Ọ̀nà yíyí dídé:
a.Dapọ cDNA
b.Dilution dilution
c.qPCR
d.Idogba ifaseyin laini lati ṣe iṣiro ṣiṣe imudara
2. LinRegPCR
LinRegPCR jẹ eto fun itupalẹ data RT-PCR akoko gidi, ti a tun pe ni pipo PCR (qPCR) data da lori SYBR Green tabi iru kemistri.Eto naa nlo data atunṣe ti kii ṣe ipilẹ, ṣe atunṣe ipilẹ lori ayẹwo kọọkan Lọtọ, ṣe ipinnu window-ti-linearity ati lẹhinna lo iṣeduro atunṣe laini lati fi ipele ti ila ti o tọ nipasẹ ipilẹ data PCR.Lati ite ti laini yii iṣẹ ṣiṣe PCR ti ayẹwo kọọkan jẹ iṣiro.Itumọ ṣiṣe PCR fun ampilifisi ati iye Ct fun ayẹwo ni a lo lati ṣe iṣiro ifọkansi ibẹrẹ fun apẹẹrẹ, ti a fihan ni awọn ẹya fluorescence lainidii.Iṣagbewọle data ati iṣelọpọ jẹ nipasẹ iwe kaunti Excel kan.Apeere nikan
dapọ wa ni ti beere, ko si gradient
Awọn igbesẹ ti wa ni ti beere:(Mu Bole CFX96 gẹgẹbi apẹẹrẹ, kii ṣe Ẹrọ pupọ pẹlu ABI ko o)
ṣàdánwò:o jẹ kan boṣewa qPCR ṣàdánwò.
Iṣẹjade data qPCR:LinRegPCR le ṣe idanimọ awọn ọna kika meji ti awọn faili ti njade: RDML tabi abajade Imudara iwọn.Ni otitọ, o jẹ iye wiwa akoko gidi ti nọmba ọmọ ati ifihan agbara fluorescence nipasẹ ẹrọ naa, ati pe imudara naa ni a gba nipasẹ ṣiṣe itupalẹ iye iyipada fluorescence ti ṣiṣe apakan laini.
Aṣayan data: Ni imọran, iye RDML yẹ ki o jẹ lilo.A ṣe iṣiro pe iṣoro kọnputa mi ni pe sọfitiwia ko le ṣe idanimọ RDML, nitorinaa Mo ni iye iṣelọpọ tayo bi data atilẹba.O ti wa ni niyanju lati ṣe kan ti o ni inira waworan ti awọn data akọkọ, gẹgẹ bi awọn ikuna ti fifi awọn ayẹwo, bbl Awọn ojuami le ti wa ni paarẹ ninu awọn ti o wu data (dajudaju, o ko ba le pa wọn, LinRegPCR yoo foju wọnyi ojuami ni nigbamii ipele)

Fig5 qPCR data okeere

Fig6 asayan ti oludije awọn ayẹwo

Iṣawọle data:Ṣii awọn abajade imudara afijẹẹri.xls, → ṣii LinRegPCR → faili → ka lati tayo → yan awọn paramita bi o ṣe han ni Nọmba 7 → O dara → tẹ pinnu awọn ipilẹ ipilẹ.

Awọn igbesẹ Fig7 ti titẹ data linRegPCR

Abajade:Ti ko ba si atunwi, ko nilo akojọpọ.Ti atunwi ba wa, akojọpọ le ṣe satunkọ ni akojọpọ apẹẹrẹ, ati pe orukọ jiini ti wa ni idamọ, lẹhinna jiini kanna yoo ni akojọpọ laifọwọyi.Ni ipari, tẹ faili naa, okeere tayo, ati wo awọn abajade.Imudara imudara ati awọn abajade R2 ti daradara kọọkan yoo han.Ni ẹẹkeji, ti o ba pin si awọn ẹgbẹ, iṣẹ ṣiṣe imudara apapọ atunṣe yoo han.Rii daju pe imudara imudara ti alakoko kọọkan wa laarin 85% ati 115%.Ti o ba tobi ju tabi kere ju, o tumọ si pe imudara imudara ti alakoko ko dara.

olusin 8 Abajade ati data o wu

Ilana idanwo:
Awọn ibeere didara RNA:
Mimo:1.72.0 tọkasi pe isothiocyanate ti o ku le wa.Nucleic acid A260 / A230 ti o mọ yẹ ki o wa ni ayika 2 .Ti o ba wa ni agbara ti o lagbara ni 230 nm, o tọka si pe awọn agbo-ara-ara-ara gẹgẹbi awọn ions phenate.Ni afikun, o le ṣee wa-ri nipasẹ 1.5% agarose gel electrophoresis.Tọkasi aami naa, nitori ssRNA ko ni denaturation ati pe logarithm iwuwo molikula ko ni ibatan laini, ati pe iwuwo molikula ko le ṣe afihan ni deede.Ifarabalẹ: Ni imọ-jinlẹkii ṣekere ju 100ng/ul, ti ifọkansi ba kere ju, mimọ ni gbogbogbo ko ga

Fig9 RNA jeli

Ni afikun, ti ayẹwo ba jẹ iyebiye ati pe ifọkansi RNA ga, o gba ọ niyanju lati sọ ọ lẹhin isediwon, ki o si di RNA si ifọkansi ikẹhin ti 100-300ng/ul fun iyipada iyipada.Ninuawọn ilana ti yiyipada transcription, nigba ti mRNA ti wa ni kikọ, oligo (dt) awọn alakoko ti o le ni pato sopọ mọ awọn iru polyA ni a lo fun iyipada iyipada, lakoko ti lncRNA ati circRNA nlo hexamer laileto (ID 6 mer) fun iyipada iyipada ti RNA lapapọ Fun miRNA, miRNA-pato transcription ọrun-loop awọn alakoko ti wa ni lilo.Ọpọlọpọ awọn ile-iṣẹ ti ṣe ifilọlẹ awọn ohun elo tailing pataki.Fun ọna yipo-yipu, ọna iru jẹ irọrun diẹ sii, gbigbe-giga, ati fifipamọ reagent, ṣugbọn ipa ti iyatọ awọn miRNA ti idile kanna ko yẹ ki o dara bi ọna stem-lupu.Ohun elo ikọsilẹ yiyipada kọọkan ni awọn ibeere fun ifọkansi ti awọn alakoko pato-jiini (awọn losiwajulosehin stem).Itọkasi inu ti a lo fun miRNA jẹ U6.Ninu ilana ti isọdọtun-lupu, tube ti U6 yẹ ki o yi pada lọtọ, ati awọn alakoko iwaju ati ẹhin ti U6 yẹ ki o ṣafikun taara.Mejeeji circRNA ati lncRNA le lo awọn HKG gẹgẹbi itọkasi inu.Ninuidanimọ cDNA,
ti ko ba si iṣoro pẹlu RNA, cDNA yẹ ki o tun dara.Sibẹsibẹ, ti o ba lepa pipe ti idanwo naa, o dara julọ lati lo apilẹṣẹ itọkasi inu (Itọkasi Itọkasi, RG) ti o le ṣe iyatọ gDNA lati cds.Ni gbogbogbo, RG jẹ jiini itọju ile., HKG) bi o han ni Figure 10;Ni akoko yẹn, Mo n ṣe amuaradagba ipamọ soybean, ati lo actin7 ti o ni awọn introns bi itọkasi inu.Ìtóbi àjákù àmújáde ti alakoko yii ni gDNA jẹ 452bp, ati pe ti cDNA ba jẹ apẹrẹ, o jẹ 142bp.Lẹhinna awọn abajade idanwo naa rii pe Apa kan ti cDNA ti doti gidi nipasẹ gDNA, ati pe o tun fihan pe ko si iṣoro pẹlu abajade ti transcription yiyipada, ati pe o le ṣee lo bi awoṣe fun PCR.Ko wulo lati ṣiṣẹ agarose gel electrophoresis taara pẹlu cDNA, ati pe o jẹ ẹgbẹ kaakiri, eyiti ko ni idaniloju.

Aworan 10 cDNA erin

Awọn ipinnu ti qPCR awọn ipoNi gbogbogbo ko si iṣoro ni ibamu si ilana ti kit, ni pataki ni igbesẹ ti iye tm.Ti o ba ti diẹ ninu awọn alakoko ko ba wa ni daradara apẹrẹ nigba alakoko oniru, Abajade ni kan ti o tobi iyato laarin awọn tm iye ati awọn tumq si 60 ° C, o ti wa ni niyanju wipe cDNA Lẹhin ti awọn ayẹwo ti wa ni adalu, ṣiṣe a gradient PCR pẹlu awọn alakoko, ati ki o gbiyanju lati yago fun ṣeto awọn iwọn otutu lai iye bi awọn TM iye.

Itupalẹ data

Ọna sisẹ pipo fluorescence ojulumo PCR jẹ ipilẹ ni ibamu si 2-ΔΔCT.Data processing awoṣe.

Awọn ọja ti o jọmọ:

Real Time PCR Easy^TM – Taqman

Real Time PCR Easy^TM -SYBR GREEN I

RT Rọrun I (Titunto Premix fun iṣelọpọ cDNA okun akọkọ)

RT Easy II (Titunto Premix fun iṣelọpọ cDNA okun akọkọ fun qPCR)