Gẹgẹbi ọkan tuntun ninu yàrá-yàrá, kii ṣe iṣẹ ti o dara lati ṣe ayẹwo awọn ohun ọgbin rere lati inu opo awọn irugbin pẹlu iwọn iyipada kekere.Ni akọkọ, DNA gbọdọ jẹ jade lati nọmba nla ti awọn ayẹwo ni ọkọọkan, lẹhinna PCR yoo rii awọn jiini ajeji.Bibẹẹkọ, awọn abajade nigbagbogbo jẹ awọn ofo ati awọn ẹgbẹ pẹlu awọn nkan diẹ lẹẹkọọkan, ṣugbọn ko ṣee ṣe lati pinnu boya awọn wiwa ti o padanu tabi wiwa eke..Ṣe o jẹ alaini iranlọwọ pupọ lati koju iru ilana idanwo ati awọn abajade bi?Maṣe yọ ara rẹ lẹnu, arakunrin kọ ọ bi o ṣe le ṣe iboju jade awọn irugbin rere transgenic ni irọrun ati deede.

Igbesẹ 1

Awọn alakoko wiwa oniru

Ṣe ipinnu apilẹṣẹ apilẹṣẹ ati jiini exogenous lati rii ni ibamu si apẹẹrẹ lati ṣe idanwo, ki o yan aṣoju 100-500bp kan ni ọna pupọ fun apẹrẹ alakoko.Awọn alakoko to dara le rii daju pe deede ti awọn abajade wiwa ati ki o kuru akoko wiwa (wo àfikún fun awọn alakoko wiwa ti a lo nigbagbogbo).

Akiyesi: Awọn alakoko ti a ṣe apẹrẹ tuntun nilo lati mu awọn ipo ifaseyin dara si ati rii daju pe deede, konge ati opin wiwa wiwa ṣaaju wiwa titobi nla.

Igbesẹ 2

Apẹrẹ esiperimenta bèèrè

Iṣakoso to dara: Lo DNA ti a sọ di mimọ ti o ni ajẹku ibi-afẹde bi awoṣe lati pinnu boya eto ifaseyin PCR ati awọn ipo jẹ deede.

Iṣakoso odi/ofo: Lo awoṣe DNA tabi ddH2O ti ko ni ajẹkù ibi-afẹde ninu bi awoṣe lati rii boya orisun ibajẹ wa ninu eto PCR.

Itọkasi itọkasi inu: lo alakoko/apapọ iwadii ti jiini endogenous ti ayẹwo lati ṣe idanwo lati ṣe iṣiro boya awoṣe le ṣee wa-ri nipasẹ PCR.

Akiyesi:

Awọn iṣakoso ti o dara, odi / ofo ati awọn iṣakoso iṣakoso inu yẹ ki o ṣeto fun idanwo kọọkan lati ṣe iṣiro idiyele ti awọn abajade esiperimenta.

Igbaradi idanwo

Ṣaaju lilo, ṣe akiyesi boya ojutu naa ti dapọ paapaa.Ti o ba rii ojoriro, o nilo lati tuka ati dapọ ni ibamu si awọn ilana ṣaaju lilo.2×PCR illa nilo lati wa ni pipetted ati ki o dapọ leralera pẹlu kan micropipette ṣaaju lilo lati yago fun uneven ion pinpin.

Akiyesi:

Mu iwe itọnisọna naa jade ki o ka ni pẹkipẹki, ki o ṣe awọn igbaradi ṣaaju idanwo ni ibamu pẹlu awọn ibeere ti itọnisọna naa.

Igbesẹ 4

Mura PCR lenu eto

Gẹgẹbi ilana ilana idanwo, dapọ awọn alakoko, H2O, ati 2 × PCR dapọ boṣeyẹ, centrifuge ati pinpin wọn si tube ifasẹyin kọọkan.

Akiyesi:

Fun idanwo iwọn-nla tabi igba pipẹ, a gba ọ niyanju lati lo eto ifasilẹ PCR ti o ni enzymu UNG, eyiti o le yago fun idoti aerosol ti o fa nipasẹ awọn ọja PCR.

Igbesẹ 5

Ṣafikun awoṣe esi

Lilo imọ-ẹrọ PCR Taara, ko si iwulo fun ilana isọdọmọ nucleic acid ti o nira, awoṣe apẹẹrẹ le ṣee pese laarin awọn iṣẹju 10, ati pe o le ṣafikun eto ifa PCR ti o baamu.

Akiyesi:

Ọna fifọ ni ipa wiwa to dara julọ, ati pe ọja ti o gba le ṣee lo fun awọn aati wiwa lọpọlọpọ.

5.1: Taara imugboroosi ti leaves

Ni ibamu si awọn iwọn ti awọn aworan ninu awọn Afowoyi, ge awọn tissu bunkun pẹlu iwọn ila opin ti 2-3mm ati ki o gbe sinu PCR lenu eto.

Akiyesi: Rii daju pe awọn ajẹkù ewe ti wa ni immersed patapata ni ojutu esi esi PCR, ati pe maṣe ṣafikun àsopọ ewe ti o pọ ju.

5.2: bunkun pipin ọna

Ge àsopọ ewe pẹlu iwọn ila opin ti 5-7mm ki o si gbe sinu tube centrifuge kan.Ti o ba yan awọn ewe ti o dagba, jọwọ yago fun lilo awọn iṣan ti iṣan akọkọ ti ewe naa.Pipette 50ul Buffer P1 lysate sinu tube centrifuge lati rii daju pe lysate le fi omi ṣan awọ ewe naa patapata, gbe e sinu cycler gbona tabi iwẹ irin, ati lyse ni 95 ° C fun awọn iṣẹju 5-10.

Ṣafikun 50ul Buffer P2 ojutu neutralization ati dapọ daradara.Abajade lysate le ṣee lo bi awoṣe kan ati ṣafikun si eto ifaseyin PCR.

Akiyesi: Iwọn awoṣe jẹ laarin 5-10% ti eto PCR, ati pe ko yẹ ki o kọja 20% (fun apẹẹrẹ, ninu eto PCR 20μl, ṣafikun 1-2μl ti ojutu lysis, kii ṣe ju 4μl).

Igbesẹ 6

PCR lenu

Lẹhin ti centrifuging awọn PCR lenu tube, o ti wa ni gbe ni a PCR irinse fun amúṣantóbi ti.

Akiyesi:

Idahun naa nlo awoṣe ti kii ṣe mimọ fun imudara, nitorinaa nọmba awọn iyipo imudara jẹ awọn iyipo 5-10 diẹ sii ju nigba lilo awoṣe DNA mimọ.

Igbesẹ 7

Wiwa Electrophoresis ati itupalẹ abajade

M: 100bp DNA Ladder

1\4: Ọna DNA ti a sọ di mimọ

2 \ 5: Taara PCR ọna

3\6: Iṣakoso ofo

QC:

Awọn abajade idanwo ti awọn iṣakoso oriṣiriṣi ti a ṣeto sinu idanwo yẹ ki o pade awọn ipo wọnyi.Bibẹẹkọ, o yẹ ki a ṣe itupalẹ idi ti iṣoro naa, ati pe idanwo naa yẹ ki o tun ṣe lẹhin ti iṣoro naa ti yọkuro.

Table 1. Awọn abajade idanwo deede ti awọn ẹgbẹ iṣakoso orisirisi

* Nigbati a ba lo plasmid bi iṣakoso rere, abajade idanwo jiini endogenous le jẹ odi

Idajọ abajade:

A. Abajade idanwo ti jiini endogenous ti ayẹwo jẹ odi, ti o nfihan pe DNA ti o yẹ fun wiwa PCR lasan ko le ṣe jade lati inu apẹẹrẹ tabi DNA ti a fa jade ni awọn inhibitors ifa PCR, ati pe o yẹ ki DNA fa jade lẹẹkansi.

B. Abajade idanwo ti jiini endogenous ti ayẹwo jẹ rere, ati abajade idanwo ti jiini exogenous jẹ odi, ti o fihan pe DNA ti o dara fun wiwa PCR lasan ni a yọ jade lati inu apẹẹrẹ, ati pe a le ṣe idajọ pe a ko rii Jiini XXX ninu apẹẹrẹ.

C. Abajade idanwo ti jiini endogenous ti ayẹwo jẹ rere, ati abajade idanwo ti jiini exogenous jẹ rere, ti o fihan pe DNA ti o yẹ fun wiwa PCR lasan ni a ti yọ jade lati inu apẹẹrẹ, ati pe DNA ayẹwo ni jiini XXX ninu.Awọn idanwo idaniloju le ṣee ṣe siwaju sii.

Igbesẹ 8

Awọn alakoko wiwa oniru

Lẹhin idanwo naa, lo 2% iṣuu soda hypochlorite ojutu ati 70% ethanol ojutu lati mu ese agbegbe idanwo naa lati yago fun idoti ayika.