一, Mu ifamọ ti eto ifamọ pọ si:

1. Yasọtọ RNA didara to gaju:

Idapọ cDNA ti o ṣaṣeyọri wa lati RNA didara ga.RNA ti o ni agbara giga yẹ ki o kere ju ni kikun-ipari ati ofe ti awọn inhibitors transcriptase yiyipada bi EDTA tabi SDS.Didara RNA pinnu iye ti o pọ julọ ti alaye ọkọọkan ti o le ṣe igbasilẹ sinu cDNA.Ọna ìwẹnumọ RNA ti o wọpọ jẹ ọna igbesẹ kan ni lilo guanidine isothiocyanate/acid phenol.Lati yago fun idoti nipasẹ iye kakiri ti RNase, RNA ti o ya sọtọ lati awọn ayẹwo RNase-ọlọrọ (gẹgẹbi ti oronro) nilo lati wa ni ipamọ ni formaldehyde lati ṣe itọju RNA didara giga, pataki fun ibi ipamọ igba pipẹ.RNA ti a fa jade lati ẹdọ eku ti bajẹ ni ipilẹ lẹhin ti o ti fipamọ sinu omi fun ọsẹ kan, lakoko ti RNA ti a fa jade lati inu eku eku wa ni iduroṣinṣin lẹhin ti o ti fipamọ sinu omi fun ọdun mẹta.Ni afikun, awọn iwe afọwọkọ to gun ju 4 kb jẹ ifarabalẹ si ibajẹ nipasẹ itọpa RNases ju awọn iwe afọwọkọ kekere lọ.Lati mu iduroṣinṣin ti awọn ayẹwo RNA ti o fipamọ, RNA le ti wa ni tituka ni formamide deionized ati fipamọ ni -70°C.Formamide ti a lo lati ṣe itọju RNA gbọdọ jẹ ofe ni idoti RNA-idibajẹ.RNA lati oronro le wa ni ipamọ ni foramide fun o kere ju ọdun kan.Nigbati o ba ngbaradi lati lo RNA, o le lo ọna atẹle lati ṣaju RNA: fi NaCl si 0.2M ati 4 igba iwọn didun ethanol, gbe ni iwọn otutu yara fun awọn iṣẹju 3-5, ati centrifuge ni 10,000 × g fun awọn iṣẹju 5.

2. Lo RNaseH-aictive (RNaseH-) yiyipada transcriptase:

Awọn inhibitors RNase nigbagbogbo ni afikun si awọn aati transcription yiyipada lati mu gigun ati ikore ti iṣelọpọ cDNA pọ si.Awọn inhibitors RNase yẹ ki o ṣafikun lakoko iṣesi iṣelọpọ okun-akọkọ ni iwaju ifipamọ ati aṣoju idinku (bii DTT), nitori ilana ṣaaju iṣelọpọ cDNA denatures inhibitor, nitorinaa dasile RNase ti a dè ti o le dinku RNA.Amuaradagba RNase inhibitors nikan ṣe idiwọ ibajẹ RNA nipasẹ RNase A, B, C, ati pe ko ṣe idiwọ RNase lori awọ ara, nitorina ṣọra ki o ma ṣe ṣafihan RNase lati awọn ika ọwọ rẹ laibikita lilo awọn inhibitors wọnyi.

Yiyipada transcriptase ṣe iyipada iyipada ti RNA si cDNA.Mejeeji M-MLV ati AMV ni iṣẹ RNaseH ailopin ni afikun si iṣẹ ṣiṣe polymerase tiwọn.Iṣẹ RNaseH ati iṣẹ ṣiṣe polymerase ti njijadu pẹlu ara wọn fun okun arabara ti a ṣẹda laarin awoṣe RNA ati alakoko DNA tabi okun itẹsiwaju cDNA, ati pe o ba okun RNA jẹ ninu RNA: eka DNA.Awoṣe RNA ti o bajẹ nipasẹ iṣẹ RNaseH ko le ṣiṣẹ bi sobusitireti ti o munadoko fun iṣelọpọ cDNA, eyiti o dinku ikore ati ipari ti iṣelọpọ cDNA.Nitorinaa, yoo jẹ anfani lati yọkuro tabi dinku iṣẹ ṣiṣe RNaseH pupọ ti transscriptase yiyipada..

SuperScript Ⅱ yiyipada transcriptase, RNaseH- MMLV ifasilẹ transcriptase ati thermoScript reverse transcriptase, RNaseH- AMV, le gba iye diẹ sii ati cDNA ni kikun-ipari ju MMLV ati AMV.Ifamọ RT-PCR yoo ni ipa nipasẹ iye akojọpọ cDNA.ThermoScript jẹ ifamọra pupọ diẹ sii ju AMV.Iwọn awọn ọja RT-PCR ni opin nipasẹ agbara ti yiyipada transcriptase lati ṣepọ cDNA, ni pataki nigbati o ba ṣe awọn cDNA ti o tobi julọ.Ti a ṣe afiwe pẹlu MMLV, SuperScripⅡ pọsi ni pataki ikore ti awọn ọja RT-PCR gigun.RNaseH-reverse transcriptase tun ti pọ si iwọn otutu, nitorinaa iṣesi le ṣee ṣe ni awọn iwọn otutu ti o ga ju deede 37-42°C.Labẹ awọn ipo iṣelọpọ ti a daba, lo oligo(dT) alakoko ati 10 μCi ti [α-P] dCTP.Apapọ ikore ti okun akọkọ jẹ iṣiro nipa lilo ọna ojoriro TCA.cDNA gigun-kikun ni a ṣe atupale nipa lilo awọn ẹgbẹ-iwọn-iwọn ti a yọkuro ati kika lori gel agarose alkaline.

3. Gbe iwọn otutu abeabo soke fun iyipada iyipada:

Iwọn otutu idabobo ti o ga julọ ṣe iranlọwọ lati ṣii eto atẹle RNA, jijẹ ikore ti iṣesi naa.Fun pupọ julọ awọn awoṣe RNA, fifa RNA ati awọn alakoko ni 65°C laisi ifipamọ tabi iyọ, atẹle nipasẹ itutu agbaiye iyara lori yinyin yoo mu imukuro ọpọlọpọ awọn ẹya ile-ẹkọ giga kuro ati gba awọn alakoko laaye lati dipọ.Sibẹsibẹ, diẹ ninu awọn awoṣe tun ni awọn ẹya atẹle, paapaa lẹhin denaturation ooru.Imudara ti awọn awoṣe ti o nira wọnyi le ṣee ṣe ni lilo ThermoScript Reverse Transcriptase ati gbigbe ifasẹyin iyipada ni iwọn otutu ti o ga julọ lati mu imudara dara si.Awọn iwọn otutu idawọle ti o ga julọ le tun pọ si ni pato, paapaa nigbati awọn alakoko-pipa-pipe (GSP) ti lo fun iṣelọpọ cDNA (wo Abala 3).Ti o ba nlo GSP, rii daju pe Tm ti awọn alakoko jẹ kanna bi iwọn otutu isubu ti a reti.Maṣe lo oligo(dT) ati awọn alakoko laileto loke 60°C.Awọn alakoko laileto nilo abeabo ni 25°C fun iṣẹju mẹwa 10 ṣaaju ki o to pọ si 60°C.Ni afikun si lilo iwọn otutu iyipada iyipada ti o ga julọ, iyasọtọ tun le ni ilọsiwaju nipasẹ gbigbe taara RNA/apo alakoko lati iwọn otutu 65 °C denaturation si iwọn otutu itọda transcription ati ṣafikun adalu ifasẹyin 2 × iṣaaju-gbona (kolaginni ibẹrẹ cDNA) .Ọna yii ṣe iranlọwọ lati yago fun sisọpọ ipilẹ intermolecular ti o waye ni awọn iwọn otutu kekere.Iyipada iwọn otutu pupọ ti o nilo fun RT-PCR le jẹ irọrun nipasẹ lilo cycler gbona.

polymerase thermostable Tth n ṣiṣẹ bi DNA polymerase ni iwaju Mg2+ ati bi RNA polymerase ni iwaju Mn2+.O le jẹ ki o gbona ni iwọn otutu ti o pọju ti 65 ° C.Bibẹẹkọ, wiwa Mn2 + lakoko PCR dinku ifaramọ, eyiti o jẹ ki Tth polymerase ko dara fun imudara-giga, gẹgẹbi cloning ti cDNA.Ni afikun, Tth ni iṣẹ ṣiṣe transcription kekere, eyiti o dinku ifamọ, ati pe, niwọn igba ti transcription yiyipada ati PCR le ṣee ṣe pẹlu enzymu kan, awọn aati iṣakoso laisi transcription yiyipada ko le ṣee lo lati ṣe afiwe awọn ọja imudara cDNA pẹlu DNA genomic ti o bajẹ.Awọn ọja ampilifaya ti yapa.

4. Awọn afikun ti o ṣe igbega transcription yiyipada:

Awọn afikun pẹlu glycerol ati DMSO ti wa ni afikun si ifarabalẹ iṣakojọpọ okun-akọkọ, eyiti o le dinku iduroṣinṣin ti nucleic acid ni ilopo-okun ati ki o ṣii ọna-atẹle ti RNA.Titi di 20% glycerol tabi 10% DMSO ni a le ṣafikun laisi ni ipa lori iṣẹ SuperScript II tabi MMLV.AMV tun le fi aaye gba to 20% glycerol laisi pipadanu iṣẹ ṣiṣe.Lati le mu ifamọ RT-PCR pọ si ni SuperScriptⅡ ifaseyin transcription, 10% glycerol le ṣe afikun ati ṣabọ ni 45°C.Ti o ba jẹ pe 1/10 ti ọja ifasilẹ iyipada ti wa ni afikun si PCR, lẹhinna ifọkansi ti glycerol ninu iṣesi imudara jẹ 0.4%, eyiti ko to lati dojuti PCR.

5. itọju RNaseH:

Itoju ti awọn aati kolaginni cDNA pẹlu RNaseH ṣaaju si PCR le ṣe alekun ifamọ.Fun diẹ ninu awọn awoṣe, a ro pe RNA ninu ifasẹpọ cDNA ṣe idilọwọ awọn abuda awọn ọja imudara, ninu eyiti itọju RNaseH le mu ifamọ pọ si.Ni gbogbogbo, itọju RNaseH ṣe pataki nigbati o ba nfi awọn awoṣe ibi-afẹde cDNA gigun ni kikun pọ si, gẹgẹbi ẹda-kekere tuberous scherosis II.Fun awoṣe ti o nira yii, itọju RNaseH mu ifihan agbara ti a ṣe nipasẹ SuperScript II tabi cDNA ti a ṣepọ AMV.Fun ọpọlọpọ awọn aati RT-PCR, itọju RNaseH jẹ iyan, nitori igbesẹ denaturation PCR ni 95°C ni gbogbogbo ṣe hydrolyzes RNA ni RNA: eka DNA.

6. Ilọsiwaju Ọna Iwari RNA Kekere:

RT-PCR jẹ nija paapaa nigbati awọn oye kekere ti RNA wa.Glycogen ti a ṣafikun bi gbigbe lakoko ipinya RNA ṣe iranlọwọ lati mu ikore ti awọn ayẹwo kekere pọ si.Glycogen-free RNase le ṣe afikun ni akoko kanna bi fifi Trizol kun.Glycogen jẹ tiotuka omi ati pe o le tọju ni ipele olomi pẹlu RNA lati ṣe iranlọwọ ojoriro ti o tẹle.Fun awọn ayẹwo ti o kere ju miligiramu 50 ti ara tabi awọn sẹẹli gbin 106, ifọkansi ti a ṣe iṣeduro ti glycogen-free RNase jẹ 250 μg/ml.

Ṣafikun BSA acetylated si ifasilẹ transcription yiyipada nipa lilo SuperScript II le ṣe alekun ifamọ, ati fun awọn iwọn kekere ti RNA, idinku iye SuperScript II ati fifi awọn ẹya 40 ti onidalẹkun nuclease RNaseOut le pọsi ipele wiwa.Ti a ba lo glycogen ninu ilana ipinya RNA, o tun ṣeduro lati ṣafikun BSA tabi inhibitor RNase nigba lilo SuperScript II fun ifasilẹ transcription yiyipada.

Mu, RT-PCR ni pato

1. Asopọmọra CND:

Iṣọkan cDNA akọkọ-akọkọ le bẹrẹ ni lilo awọn ọna oriṣiriṣi mẹta, iyasọtọ ibatan eyiti o ni ipa lori iye ati iru cDNA ti ṣajọpọ.

Awọn ID alakoko ọna wà ni o kere kan pato ti awọn ọna mẹta.Awọn alakoko anneal ni ọpọ awọn aaye jakejado awọn tiransikiripiti, ti o npese kukuru, apa kan-ipari cDNAs.Ọna yii ni a maa n lo nigbagbogbo lati gba awọn ilana ipari 5 ′ ati lati gba cDNA lati awọn awoṣe RNA pẹlu awọn agbegbe ti eto ile-ẹkọ keji tabi pẹlu awọn aaye ifopinsi ti a ko le ṣe atunṣe nipasẹ yiyipada transcriptase.Lati gba cDNA ti o gunjulo, ipin ti awọn alakoko si RNA ni ayẹwo RNA kọọkan nilo lati pinnu ni agbara.Ifojusi ibẹrẹ ti awọn alakoko laileto wa lati 50 si 250 ng fun iṣesi 20 μl.Niwọn igba ti cDNA ti ṣajọpọ lati RNA lapapọ nipa lilo awọn alakoko laileto jẹ nipataki ribosomal RNA, poly(A)+ RNA ni gbogbogbo ti yan gẹgẹbi awoṣe.

Awọn alakoko Oligo(dT) jẹ pato diẹ sii ju awọn alakoko laileto.O ṣe arabara si iru poly(A) ti a rii ni opin 3′ ti awọn mRNA eukaryotic pupọ julọ.Nitori poli(A)+ RNA jẹ isunmọ 1% si 2% ti lapapọ RNA, iye ati idiju ti cDNA kere pupọ ju pẹlu awọn alakoko laileto.Nitori iyasọtọ giga rẹ, oligo(dT) ni gbogbogbo ko nilo iṣapeye ti ipin RNA si awọn alakoko ati yiyan poly(A)+.O ti wa ni niyanju lati lo 0.5μg oligo(dT) fun 20μl lenu eto.oligo (dT) 12-18 ni o dara fun julọ RT-PCR.Eto ThermoScript RT-PCR nfunni oligo (dT) 20 nitori iduroṣinṣin igbona ti o dara julọ fun awọn iwọn otutu idawọle ti o ga julọ.

Awọn alakoko Gene kan pato (GSP) jẹ awọn alakoko pataki julọ fun igbesẹ transcription yiyipada.GSP jẹ oligonucleotide antisense ti o le ṣe arabara ni pataki si ọna ibi-afẹde RNA, ko dabi awọn alakoko laileto tabi oligo(dT), eyiti o fa si gbogbo awọn RNA.Awọn ofin kanna ti a lo lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko PCR lo si apẹrẹ GSP ni awọn aati transcription yiyipada.GSP le jẹ ọkọọkan kanna bi alakoko ampilifaya ti o fa si 3′-julọ opin mRNA, tabi GSP le jẹ apẹrẹ lati mu isale isalẹ ti alakoko imudara yiyipada.Fun diẹ ninu awọn koko-ọrọ ti a sọkun, diẹ sii ju ọkan alakoko antisense nilo lati ṣe apẹrẹ fun aṣeyọri RT-PCR nitori pe eto-atẹle ti RNA ibi-afẹde le ṣe idiwọ abuda alakoko.A gba ọ niyanju lati lo 1 pmol antisense GSP ni 20 μl ifasẹpọ okun-akọkọ.

2. Gbe iwọn otutu abeabo soke fun iyipada iyipada:

Lati le ni anfani ni kikun ti anfani ni kikun ti pato GSP, transscriptase yiyipada pẹlu iwọn otutu ti o ga julọ yẹ ki o lo.Awọn iwe afọwọkọ yiyipada thermostable le jẹ idabo ni awọn iwọn otutu ti o ga lati mu okun ifa pọ si.Fún àpẹrẹ, tí GSP kan bá ṣàmúlò ní 55°C, ìpesífififififipamọ́ GSP kii yoo jẹ lilo ni kikun ti AMV tabi M-MLV ba jẹ lilo fun iyipada iyipada ni okun kekere ti 37°C.Sibẹsibẹ, SuperScript II ati ThermoScript le ṣe ni 50°C tabi ju bẹẹ lọ, eyi ti yoo ṣe imukuro awọn ọja ti kii ṣe pato ti ipilẹṣẹ ni awọn iwọn otutu kekere.Fun iyasọtọ ti o pọju, RNA/apo alakoko le ṣee gbe taara lati iwọn otutu denaturation 65°C si iwọn otutu itọdasilẹ yiyipada ati ṣafikun si idapọ ifura 2 × iṣaaju-igbona (ibẹrẹ cDNA iṣelọpọ gbona).Eyi ṣe iranlọwọ lati yago fun sisọpọ ipilẹ intermolecular ni awọn iwọn otutu kekere.Awọn iyipada iwọn otutu pupọ ti o nilo fun RT-PCR le jẹ irọrun nipasẹ lilo cycler gbona.

3. Din jenomic DNA koti:

Isoro ti o pọju ti o ba pade pẹlu RT-PCR jẹ ibajẹ ti DNA jinomiki ninu RNA.Lilo ọna ipinya RNA ti o dara, gẹgẹbi Trizol Reagent, yoo dinku iye DNA jinomiki ti n ba igbaradi RNA jẹ.Lati yago fun awọn ọja ti o wa lati inu DNA jiini, RNA le ṣe itọju pẹlu imudara-ite DNAse I lati yọ DNA ti o ni idoti ṣaaju iyipada iyipada.Digestion DNase I ti fopin si nipa gbigbe awọn ayẹwo ni 2.0 mM EDTA fun awọn iṣẹju 10 ni 65°C.EDTA le chelate iṣuu magnẹsia ions, idilọwọ iṣuu magnẹsia ion-ti o gbẹkẹle RNA hydrolysis ni awọn iwọn otutu giga.

Lati le ya cDNA ti o ni imudara kuro lati idoti awọn ọja imudara DNA jiini, awọn alakoko le ṣe apẹrẹ ti ọkọọkan lati ya awọn exons lọtọ.Awọn ọja PCR ti o wa lati cDNA yoo kuru ju awọn ti o wa lati inu DNA genomic ti a ti doti.Ni afikun, idanwo iṣakoso laisi iyipada iyipada ni a ṣe lori awoṣe RNA kọọkan lati pinnu boya ajẹkù ti a fun ni yo lati DNA jiini tabi cDNA.Ọja PCR ti o gba laisi iyipada iyipada jẹ yo lati inu jiini.