Ⅰ. Ṣe alekun ifamọ ti eto ifa:
1. Iyatọ giga-didara RNA:
Idapọ cDNA ti o ṣaṣeyọri wa lati RNA didara ga.Didara giga RNA yẹ ki o rii daju o kere ju lapapọ gun ati pe ko ni awọn inhibitors ti ko ni awọn enzymu gbigbasilẹ ninu, gẹgẹbi EDTA tabi SDS.Didara RNA pinnu iye ti o pọju ti alaye ọkọọkan ti o le ṣe igbasilẹ si cDNA.Ọna ìwẹnumọ RNA gbogbogbo jẹ ọna igbesẹ ti lilo isoocyanate/acidophenol.Lati yago fun idoti ti RNase, RNA ya sọtọ lati inu apẹẹrẹ ọlọrọ ni RNase (gẹgẹbi ti oronro) nilo ibi ipamọ ti formaldehyde lati ṣafipamọ RNA ti o ni agbara giga, eyiti o jẹ diẹ sii fun ibi ipamọ igba pipẹ.RNA ti o jade lati ẹdọ eku ti bajẹ lẹhin ọsẹ kan ti ibi ipamọ ninu omi, lakoko ti RNA ti a fa jade lati inu eegun eku wa ni iduroṣinṣin lẹhin ọdun mẹta ti ipamọ ninu omi.Ni afikun, awọn iwe afọwọkọ ti o tobi ju 4kb jẹ ifarabalẹ si itọpa ibajẹ RNase ju awọn iwe afọwọkọ kekere lọ.Lati le mu iduroṣinṣin ti ayẹwo RNA ipamọ sii, RNA le ti wa ni tituka ni methalmamine ti ion, ati pe o wa ni ipamọ -70 °C.Thylide ti a lo lati fipamọ RNA ko gbọdọ ni ohun oriṣiriṣi kan ti o dinku RNA.RNA, eyiti o jẹ lati inu oronro, le wa ni fipamọ ni methammamine fun o kere ju ọdun kan.Nigbati o ba ṣetan lati lo RNA, o le lo awọn ọna wọnyi lati ṣaju RNA: ṣafikun NaCl si 0.2m ati awọn akoko 4 iwọn ethanol, gbe iwọn otutu yara fun awọn iṣẹju 3-5, ati 10,000 × g centrifugal fun awọn iṣẹju 5.
2. Lo yiyipada transcriptase laisi iṣẹ RNaseH (RNaseH-):
Awọn inhibitors RNase nigbagbogbo ni afikun si awọn aati transcription yiyipada lati mu gigun ati ikore ti iṣelọpọ cDNA pọ si.A ṣe afikun inhibitor RNase ni ifasẹpọ pq akọkọ ni iwaju awọn buffers ati idinku awọn aṣoju bii DTT nitori ilana iṣelọpọ iṣaaju-cDNA denatures inhibitor, nitorinaa dasile awọn RNases ti a dè ti o dinku RNA.Amuaradagba RNase inhibitor nikan ṣe idilọwọ ibajẹ RNA nipasẹ RNase A, B, C, ati pe ko ṣe idiwọ awọn RNases lori awọ ara, nitorinaa o yẹ ki o ṣọra lati ma ṣe ṣafihan RNases lati awọn ika ọwọ laibikita lilo awọn inhibitors wọnyi.
Yiyipada transcriptase ṣe iyipada iyipada ti RNA sinu cDNA.Mejeeji M-MLV ati AMV ni iṣẹ RNaseH ailopin ni afikun si iṣẹ ṣiṣe polymerase tiwọn.Iṣẹ ṣiṣe RNaseH dije pẹlu iṣẹ ṣiṣe polymerase fun awọn okun heterozygous ti a ṣẹda laarin awọn awoṣe RNA ati awọn alakoko DNA tabi awọn okun itẹsiwaju cDNA, o si degrades RNA: awọn okun RNA ni awọn eka DNA.Awọn awoṣe RNA ti o bajẹ nipasẹ iṣẹ RNaseH ko le ṣee lo bi awọn sobusitireti ti o munadoko fun iṣelọpọ cDNA, idinku ikore ati ipari ti iṣelọpọ cDNA.Nitorinaa imukuro tabi idinku iṣẹ RNaseH pupọ ti transcriptase yiyipada yoo jẹ anfani nla.
SuperScriptⅡ iyipada transcriptase, MMLV yiyipada transcriptase ti RNaseH- ati thermoScript yiyipada transcriptase, AMV ti RNaseH- mu cDNA ni kikun-ipari ju MMLV ati AMV.Ifamọ RT-PCR ni ipa nipasẹ iye cDNA ti a ṣepọ.ThermoScript jẹ ifamọra pupọ diẹ sii ju AMV.Iwọn awọn ọja RT-PCR ni opin nipasẹ agbara ti yiyipada transcriptase lati ṣepọ cDNA, ni pataki nigbati o ba npọ Cdnas nla.Ti a ṣe afiwe pẹlu MMLV, SuperScripⅡ pọsi ni pataki ikore ti awọn ọja RT-PCR gigun.RNaseH-'s reverse transcriptase tun mu iduroṣinṣin gbona pọ si, nitorinaa iṣesi le ṣee ṣe ni awọn iwọn otutu ti o ga ju deede ti 37-42℃.Labẹ awọn ipo iṣelọpọ ti a daba, awọn alakoko oligo(dT) ati 10μCi [alpha-p] dCTP ni a lo.Lapapọ iṣelọpọ pq akọkọ jẹ iṣiro nipa lilo ọna ojoriro TCA.cDNA gigun-kikun ni a ṣe atupale nipa lilo yiyọ kuro ni iwọn iwọn ati kika ninu jeli agarose ipilẹ.
3. Mu iwọn otutu itọju ooru pọ si ti transcription yiyipada:
Iwọn otutu didimu ti o ga julọ ṣe iranlọwọ lati ṣii eto Atẹle ti RNA ati mu ikore ti iṣesi pọ si.Fun pupọ julọ awọn awoṣe RNA, didimu RNA ati alakoko ni 65°C laisi ifipamọ tabi iyọ ati lẹhinna itutu wọn ni iyara lori yinyin yọkuro pupọ julọ awọn ẹya atẹle ati gba awọn alakoko laaye lati dipọ.Bibẹẹkọ, diẹ ninu awọn awoṣe tun ni eto atẹle, paapaa lẹhin denaturation gbona.Imudara ti awọn awoṣe ti o nira wọnyi le ṣee ṣe ni lilo ThermoScript yiyipada transcriptase ati nipa gbigbe ifasẹyin iyipada transcriptase ni awọn iwọn otutu ti o ga lati mu ilọsiwaju dara si.Awọn iwọn otutu ti o ga julọ le tun mu iyasọtọ pọ si, paapaa nigba ti iṣelọpọ cDNA ṣe ni lilo awọn alakoko-pipa pato (GSPS) (wo Abala 3).Ti o ba nlo GSP, rii daju pe iye Tm ti alakoko jẹ kanna bi iwọn otutu idaduro ti a reti.Maṣe lo oligo(dT) ati awọn alakoko laileto loke 60℃.Awọn alakoko laileto nilo lati waye ni 25 ℃ fun iṣẹju mẹwa 10 ṣaaju ki o to pọ si 60℃.Ni afikun si lilo awọn iwọn otutu iyipada iyipada ti o ga julọ, pato le ni ilọsiwaju nipasẹ gbigbe taara RNA/adapọ alakoko lati iwọn otutu 65 ℃ denaturing si iwọn otutu itusilẹ yiyipada ati ṣafikun adalu ifasẹyin 2 × preheated (kolaginni ibẹrẹ gbona cDNA).Ọna yii ṣe iranlọwọ lati yago fun sisọpọ ipilẹ intermolecular ti o waye ni awọn iwọn otutu kekere.Lilo ohun elo PCR jẹ irọrun ọpọlọpọ awọn iyipada iwọn otutu ti o nilo fun RT-PCR.
Tth ooru ti muduro polymerase ṣiṣẹ bi DNA polymerase ni iwaju Mg2+ ati RNA polymerase ni iwaju Mn2+.O le mu ooru duro ni iwọn 65 ℃.Bibẹẹkọ, wiwa Mn2 + lakoko PCR dinku ifaramọ, eyiti o jẹ ki Tth polymerase ko dara fun imudara pipe to gaju, bii cloning cDNA.Ni afikun, Tth ko ṣiṣẹ daradara ni iyipada iyipada, eyiti o dinku ifamọ, ati pe niwọn igba ti enzymu kan le ṣe iyipada iyipada ati PCR, awọn aati iṣakoso laisi transcription yiyipada ko le ṣee lo lati ṣe iyatọ awọn ọja imudara ti cDNA lati awọn ti DNA genomic ti doti.
4. Afikun ti o ṣe igbega transcription yiyipada:
Ipilẹṣẹ awọn afikun, pẹlu glycerin ati DMSO, si ifasẹpọ pq akọkọ le dinku iduroṣinṣin ti okun ilọpo meji ti nucleic acid ati yọkuro eto atẹle RNA naa.Titi di 20% glycerin tabi 10% DMSO ni a le ṣafikun laisi ni ipa iṣẹ ṣiṣe ti SuperScriptⅡ tabi MMLV.AMV tun le fi aaye gba to 20% glycerol laisi idinku iṣẹ-ṣiṣe.Lati mu ifamọ RT-PCR pọ si ni SuperScriptⅡ ifaseyin transcription, 10% glycerol le ṣafikun ati ya sọtọ ni 45℃.Ti 1/10 ti ọja ifasilẹ-retrotranscription ti wa ni afikun si PCR, ifọkansi ti glycerol ninu iṣesi imudara jẹ 0.4%, eyiti ko to lati dojuti PCR.
5. RNaseH processing:
Ifamọ le ni ilọsiwaju nipasẹ ṣiṣe itọju awọn aati idapọ cDNA pẹlu RNaseH ṣaaju PCR.Fun diẹ ninu awọn awoṣe, a ro pe RNA ti o wa ninu ifarapa iṣelọpọ cDNA ṣe idilọwọ isopọmọ ti awọn ọja ti o pọ si, ninu eyiti itọju RNaseH le ṣe alekun ifamọ.Ni gbogbogbo, itọju RNaseH nilo fun imudara ti awoṣe ibi-afẹde cDNA gigun ni kikun, gẹgẹbi scherosis tuberous pẹlu ẹda kekere.Fun awoṣe ti o nira yii, RNaseH ṣe imudara ifihan agbara ti ipilẹṣẹ nipasẹ cDNA ti a ṣepọ nipasẹ SuperScriptⅡ tabi AMV.Fun ọpọlọpọ awọn aati RT-PCR, itọju RNaseH jẹ iyan nitori pe 95℃ ti o ya sọtọ PCR igbese denaturation ojo melo ṣe hydrolyzes RNA lati RNA: eka DNA.
6. Awọn ọna ilọsiwaju fun wiwa awọn oye kekere ti RNA:
RT-PCR jẹ nija paapaa nigbati awọn oye kekere ti RNA wa.Awọn afikun ti glycogen bi a ti ngbe nigba RNA Iyapa iranlọwọ lati mu ikore ti kekere awọn ayẹwo.Glycogen ti ko ni RNase le ṣe afikun ni akoko kanna bi Trizol.Glycogen jẹ tiotuka omi ati pe o le wa ni ipele omi pẹlu RNA lati ṣe iranlọwọ ni ojoriro ti o tẹle.Idojukọ iṣeduro ti glycogen-free RNase jẹ 250μg/ml fun awọn ayẹwo ti o kere ju 50mg ti ara tabi awọn sẹẹli gbin 106.
Ipilẹṣẹ BSA acetylated lati yiyipada awọn aati transcription nipa lilo SuperScriptⅡ le mu ifamọ pọ si, ati fun awọn iwọn kekere ti RNA, idinku iye SuperScriptⅡ ati fifi awọn ẹya 40 ti RnaseOut nuclease inhibitor le mu ipele wiwa dara si.Ti a ba lo glycogen ni ipinya RNA, afikun ti BSA tabi awọn inhibitors RNase lati yi awọn aati transcription pada nipa lilo SuperScriptⅡ ni a tun gbaniyanju.
Ⅱ. Mu pato ti RT-PCR pọ si
1. cNDA kolaginni:
Awọn ọna oriṣiriṣi mẹta ni a le lo lati pilẹṣẹ iṣọpọ cDNA okun akọkọ, ati pe pato ibatan ti ọna kọọkan yoo ni ipa lori iye ati iru cDNA ti ṣajọpọ.
Ọna alakoko ID jẹ pato ti o kere julọ ti awọn ọna mẹta.Awọn alakoko ti wa ni piparẹ ni awọn aaye lọpọlọpọ jakejado tiransikiripiti lati ṣe agbejade kukuru, cDNA gigun apa kan.Ọna yii ni igbagbogbo lo lati gba awọn ilana ebute 5 ′ ati cDNA lati awọn awoṣe RNA pẹlu awọn agbegbe igbekalẹ keji tabi pẹlu awọn aaye ipari ti o yiyipada transcriptase ko le ṣe ẹda.Lati gba cDNA ti o gunjulo, ipin ti awọn alakoko si RNA ni ayẹwo RNA kọọkan nilo lati pinnu ni agbara.Idojukọ akọkọ ti awọn alakoko laileto wa lati 50 si 250ng fun eto ifaseyin 20μl.Nitori cDNA ti a ṣepọ lati RNA lapapọ ni lilo awọn alakoko laileto jẹ RNA ribosomal ni pataki, poly(A)+ RNA ni gbogbogbo ti yan gẹgẹbi awoṣe.
Ibẹrẹ Oligo(dT) jẹ pato diẹ sii ju awọn alakoko laileto.O ṣe arabara pẹlu iru poly(A) ti a rii ni opin 3' ti mRNA ni ọpọlọpọ awọn sẹẹli eukaryotic.Nitori poli(A)+RNA jẹ aijọju 1% si 2% ti lapapọ RNA, iye ati idiju ti cDNA kere pupọ ju ti o ba lo awọn alakoko laileto.Nitori iyasọtọ giga rẹ, oligo(dT) ni gbogbogbo ko nilo iṣapeye fun RNA si ipin alakoko ati yiyan poly(A)+.O ti wa ni niyanju lati lo 0.5μg oligo(dT) fun 20μl lenu eto.oligo (dT) 12-18 ni o dara fun julọ RT-PCR.ThermoScript RT-PCR System n pese oligo (dT) 20 nitori iduroṣinṣin igbona ti o dara ati pe o dara fun awọn iwọn otutu ti o ga julọ.
Awọn alakoko-pipe-pipe (GSP) jẹ awọn alakoko kan pato ti o dara julọ fun igbesẹ transcription yiyipada.GSP jẹ oligonucleoside antisense ti o le ṣe arabara ni pataki pẹlu awọn ilana ibi-ajo RNA, kuku ju anneal gbogbo awọn Rna bi awọn alakoko laileto tabi oligo(dT).Awọn ofin ti a lo lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko PCR tun kan si apẹrẹ ti ifaseyin transcription GSP.GSP le jẹ ọkọọkan kanna bi alakoko ampilifaya ti a fi silẹ ni opin mRNA3′, tabi GSP le ṣe apẹrẹ lati di annealed ni isalẹ ṣiṣan pẹlu alakoko ampilifaya yiyipada.Fun diẹ ninu awọn ohun ti o ni imudara, o jẹ dandan lati ṣe apẹrẹ diẹ ẹ sii ju ọkan antisense alakoko fun aṣeyọri RT-PCR nitori eto atẹle ti RNA ibi-afẹde le ṣe idiwọ alakoko lati dipọ.O ni imọran lati lo 1pmol antisense GSP ni eto ifasẹpọ pq akọkọ ti 20μl.
2. Mu iwọn otutu itọju ooru pọ si ti transcription yiyipada:
Lati le ni anfani ni kikun ti pato GSP, yiyipada transcriptase pẹlu iduroṣinṣin igbona giga yẹ ki o lo.Transscriptase yiyipada ooru-idurosinsin le jẹ idayatọ ni awọn iwọn otutu ti o ga lati ṣe alekun lile ifaseyin.Fun apẹẹrẹ, ti GSP kan ba jẹ ifikun ni 55°C, lẹhinna pato ti GSP ko ni lilo ni kikun ti a ba ṣe transcription yiyipada ni 37°C pẹlu rigor kekere nipa lilo AMV tabi M-MLV.Sibẹsibẹ, SuperScripⅡ ati ThermoScript le fesi ni 50℃ tabi ju bẹẹ lọ, eyiti o yọkuro awọn ọja ti kii ṣe pato ti a ṣe ni awọn iwọn otutu kekere.Fun iyasọtọ ti o pọ julọ, adalu RNA / alakoko le ṣee gbe taara lati iwọn otutu denaturation 65 ℃ si iwọn otutu didimu transcription yiyipada pẹlu afikun ti adalu ifasẹyin 2 x preheated (ibẹrẹ igbona ti iṣelọpọ cDNA).Eyi ṣe iranlọwọ fun idilọwọ sisọpọ ipilẹ laarin awọn ohun elo ni awọn iwọn otutu kekere.Lilo ohun elo PCR jẹ irọrun ọpọlọpọ awọn iyipada iwọn otutu ti o nilo fun RT-PCR.
3. Din jenomic DNA koti:
Isoro kan ti o pọju pẹlu RT-PCR ni pe RNA jẹ ibajẹ DNA jinomiki.Lilo awọn ọna iyapa RNA ti o dara julọ, gẹgẹbi Trizol Reagent, dinku idoti jiini DNA ni awọn igbaradi RNA.Lati yago fun awọn ọja ti a ṣejade lati inu DNA jiini, RNA le ṣe itọju pẹlu iwọn amúṣantóbi ti DNAⅠ lati yọ DNA ti o ti doti kuro ṣaaju iyipada iyipada.Awọn ayẹwo naa wa ni 65℃ ni 2.0mM EDTA fun iṣẹju 10 lati fopin si tito nkan lẹsẹsẹ DNAseⅠ.EDTA chelates iṣuu magnẹsia ions lati ṣe idiwọ iṣuu magnẹsia ion ti o gbẹkẹle RNA hydrolysis ti o waye ni awọn iwọn otutu giga.
Lati le ya cDNA ampilifaya kuro ninu ọja imudara jiini-jiini, awọn alakoko ti o fa ni lọtọ pẹlu exon ti o yapa le ṣe apẹrẹ.Awọn ọja PCR ti o wa lati cDNA yoo kuru ju awọn ti o wa lati inu DNA genomic ti a ti doti.Idanwo iṣakoso laisi iyipada iyipada ni a tun ṣe lori awoṣe RNA kọọkan lati pinnu boya ajẹkù ti a fun ni lati DNA jiini tabi cDNA.Awọn ọja PCR ti a gba ni isansa ti transcription yiyipada jẹ yo lati jiini.
Ọja ibatan
- Ohun elo igbese kan jẹ ki transcription yiyipada ati PCR ṣee ṣe ni tube kanna.O nilo lati ṣafikun awoṣe RNA nikan, awọn alakoko PCR kan pato ati RNase-Ọfẹ ddH2O.
-Itupalẹ pipo akoko gidi ti RNA le ṣee ṣe ni iyara ati deede.
-Apo naa nlo iyasọtọ Foregene yiyipada reagent transcription ati Foregene HotStar Taq DNA Polymerase ni idapo pẹlu eto ifalọ alailẹgbẹ lati mu imunadoko imudara imudara ati pato ifa.
-Eto imudara iṣapeye jẹ ki iṣesi naa ni ifamọra wiwa ti o ga julọ, iduroṣinṣin igbona ti o lagbara, ati ifarada to dara julọ.
-Agbara daradara lati yọ gDNA kuro, eyiti o le yọ gDNA kuro ninu awoṣe laarin awọn iṣẹju 2.
-Eto iyipada iyipada ti o munadoko, o gba iṣẹju 15 nikan lati pari iṣelọpọ ti cDNA okun akọkọ.
- Awọn awoṣe eka: awọn awoṣe pẹlu akoonu GC giga ati eto ile-ẹkọ giga ti eka le tun yipada pẹlu ṣiṣe giga.
-Eto ifamọ yiyipada ọna kika, awọn awoṣe pg-ipele tun le gba cDNA didara ga.
-Eto transcription yiyipada ni iduroṣinṣin igbona giga, iwọn otutu ti o dara julọ jẹ 42 ℃, ati pe o tun ni iṣẹ iṣipopada ti o dara ni 50℃.
Akoko ifiweranṣẹ: Mar-07-2023
