1. Imọ ipilẹ (ti o ba fẹ wo apakan idanwo, jọwọ gbe taara si apakan keji)
Gẹgẹbi itọsẹ itọsẹ ti PCR ti aṣa, PCR akoko gidi ṣe abojuto iyipada ti iye ọja imudara ni ọmọ kọọkan ti iṣesi imudara PCR ni akoko gidi nipasẹ iyipada ti ifihan agbara fluorescence, ati ni pipọ ṣe itupalẹ awoṣe ibẹrẹ nipasẹ ibatan laarin iye ct ati te boṣewa.
Awọn pato data ti RT-PCR niipilẹṣẹ, Filorescence alaatiiye Ct.
| ipilẹ: | Iwọn fluorescence ti 3rd-15th ọmọ jẹ ipilẹ-ipilẹ (ipilẹ), eyiti o ṣẹlẹ nipasẹ aṣiṣe lẹẹkọọkan ti wiwọn. |
| Ipele (ala): | Ntọkasi opin wiwa fluorescence ti a ṣeto ni ipo ti o yẹ ni agbegbe idagbasoke ti iwọn ti ohun ti tẹ imudara, ni gbogbo igba 10 ni iwọn iyapa ti ipilẹ. |
| Iye CT: | O jẹ nọmba awọn iyipo PCR nigbati iye fluorescence ninu tube ifasẹ kọọkan ba de opin. Iye Ct jẹ iwọn inversely si iye awoṣe akọkọ. |
Awọn ọna isamisi ti o wọpọ fun RT-PCR:
| ọna | anfani | aipe | dopin ti ohun elo |
| SYBR GreenⅠ | Wiwo jakejado, ifarabalẹ, olowo poku ati irọrun | Awọn ibeere alakoko jẹ giga, itara si awọn ẹgbẹ ti kii ṣe pato | O dara fun itupalẹ pipo ti ọpọlọpọ awọn jiini ibi-afẹde, iwadii lori ikosile pupọ, ati iwadii lori awọn ẹranko ati awọn ohun ọgbin transgenic recombinant. |
| TaqMan | Ti o dara ni pato ati ki o ga repeatability | Iye owo naa ga ati pe o dara nikan fun awọn ibi-afẹde kan pato. | Ṣiṣawari arun aisan, iwadii jiini resistance oogun, igbelewọn ipa oogun, iwadii aisan ti jiini. |
| molikula tan ina | Ni pato giga, fluorescence, abẹlẹ kekere | Iye owo naa ga, o dara nikan fun idi kan pato, apẹrẹ naa nira, ati pe idiyele naa ga. | Specific gene onínọmbà, SNP onínọmbà |
2. Awọn igbesẹ idanwo
2.1 Nipa akojọpọ esiperimenta- ọpọlọpọ awọn kanga gbọdọ wa ninu ẹgbẹ, ati pe awọn atunwi ti ibi gbọdọ wa.
| ① | Iṣakoso ofo | Ti a lo lati ṣawari ipo idagbasoke sẹẹli ni awọn idanwo |
| ② | Iṣakoso odi siRNA (ilana siRNA ti kii ṣe pato) | Ṣe afihan pato iṣe RNAi.siRNA le fa idahun aapọn ti kii ṣe pato ni ifọkansi ti 200nM. |
| ③ | Iṣakoso Reagent gbigbe | Yasọtọ majele ti reagent gbigbe si awọn sẹẹli tabi ipa lori ikosile ti jiini ibi-afẹde |
| ④ | siRNA lodi si jiini afojusun | Kọlu ikosile ti jiini ibi-afẹde |
| ⑤ (aṣayan) | rere siRNA | Lo lati laasigbotitusita eto esiperimenta ati awọn iṣoro iṣẹ |
| ⑥ (aṣayan) | Fuluorisenti Iṣakoso siRNA | Iṣiṣẹ ti gbigbe sẹẹli le ṣe akiyesi pẹlu maikirosikopu kan |
2.2 Awọn ilana ti apẹrẹ alakoko
| Iwọn ajẹkù ti o pọ | O dara julọ ni 100-150bp |
| Alakoko Gigun | 18-25bp |
| GC akoonu | 30% -70%, pelu 45% -55% |
| Tm iye | 58-60 ℃ |
| Ọkọọkan | Yago fun T / C lemọlemọfún;A/G lemọlemọfún |
| 3 opin ọkọọkan | Yago fun GC ọlọrọ tabi AT ọlọrọ;ipilẹ ebute jẹ pelu G tabi C;o dara julọ lati yago fun T |
| Ibaramu | Yago fun awọn ilana ibaramu ti o ju awọn ipilẹ mẹta lọ laarin alakoko tabi laarin awọn alakoko meji |
| Ni pato | Lo wiwa bugbamu lati jẹrisi pato alakoko |
①SiRNA jẹ ẹya-pato, ati awọn ilana ti awọn oriṣiriṣi oriṣiriṣi yoo yatọ.
② SiRNA ti wa ni akopọ ninu erupẹ ti o gbẹ, eyiti o le wa ni ipamọ ni iduroṣinṣin fun awọn ọsẹ 2-4 ni iwọn otutu yara.
2.3 Awọn irinṣẹ tabi reagents ti o nilo lati wa ni pese sile ilosiwaju
| Alakoko (itọkasi inu) | Pẹlu siwaju ati yiyipada meji |
| Awọn alakoko (aini ibi-afẹde) | Pẹlu siwaju ati yiyipada meji |
| Àfojúsùn Si RNA (awọn ila mẹta) | Ni gbogbogbo, ile-iṣẹ yoo ṣajọpọ awọn ila 3, lẹhinna yan ọkan ninu awọn mẹta nipasẹ RT-PCR |
| Apo gbigbe | Lipo2000 ati be be lo. |
| RNA Dekun isediwon Apo | Fun isediwon RNA lẹhin gbigbe |
| Dekun yiyipada Transcription Apo | fun cDNA kolaginni |
| PCR Ampilifaya Apo | 2× Super SYBR Alawọ ewe qPCR Titunto Mix |
2.4 Nipa awọn ọran ti o nilo lati san ifojusi si ni awọn igbesẹ idanwo kan pato:
①siRNA ilana gbigbe
1. Fun plating, o le yan 24-daradara awo, 12-daradara awo tabi 6-daradara awo (apapọ ifọkansi RNA dabaa ni kọọkan kanga ti a 24-daradara awo jẹ nipa 100-300 ng / uL), ati awọn ti aipe gbigbe iwuwo ti awọn sẹẹli jẹ soke si 60% -80% tabi bẹ.
2. Awọn igbesẹ gbigbe ati awọn ibeere pataki jẹ muna ni ibamu pẹlu awọn ilana.
3. Lẹhin gbigbe, awọn ayẹwo le ṣee gba laarin awọn wakati 24-72 fun wiwa mRNA (RT-PCR) tabi wiwa amuaradagba laarin awọn wakati 48-96 (WB)
② Ilana isediwon RNA
1. Dena ibajẹ nipasẹ awọn enzymu exogenous.O kun pẹlu wiwọ awọn iboju iparada ati awọn ibọwọ muna;lilo sterilized pipette awọn italolobo ati EP tubes;omi ti a lo ninu idanwo naa gbọdọ jẹ Ọfẹ RNase.
2. A ṣe iṣeduro lati ṣe lẹmeji bi a ti daba ninu ohun elo isediwon ti o yara, eyi ti yoo mu imudara ati ikore dara gaan.
3. Omi egbin ko gbọdọ fi ọwọ kan ọwọn RNA.
③ Iwọn RNA
Lẹhin ti RNA ti jade, o le ṣe iwọn taara pẹlu Nandrop, ati pe kika ti o kere julọ le jẹ kekere bi 10ng/ul.
④ Yiyipada ilana transcription
1. Nitori ifamọ giga ti RT-qPCR, o kere ju 3 awọn kanga ti o jọra yẹ ki o ṣe fun ayẹwo kọọkan lati ṣe idiwọ Ct ti o tẹle lati jẹ iyatọ pupọ tabi SD lati tobi ju fun itupalẹ iṣiro.
2. Ma ṣe di ati ki o Thaw Titunto illa leralera.
3. Kọọkan tube / iho gbọdọ wa ni rọpo pẹlu titun kan sample!Maṣe lo itọpa pipette kanna nigbagbogbo lati ṣafikun awọn ayẹwo!
4. Fiimu ti a so si awo 96-daradara lẹhin ti o fi kun awọn ayẹwo nilo lati wa ni didan pẹlu awo kan.O dara julọ lati centrifuge ṣaaju ki o to fi sori ẹrọ naa, ki omi ti o wa lori ogiri tube le ṣan silẹ ki o si yọ awọn nyoju afẹfẹ kuro.
⑤ Iṣayẹwo ti o wọpọ
| Ko si akoko idagbasoke logarithmic | O ṣee ga ifọkansi ti awoṣe |
| Ko si iye CT | Awọn igbesẹ ti ko tọ fun wiwa awọn ifihan agbara Fuluorisenti; ibajẹ ti awọn alakoko tabi awọn iwadii - iduroṣinṣin rẹ le ṣee wa-ri nipasẹ PAGE electrophoresis; insufficient iye ti awoṣe; ibajẹ awọn awoṣe - yago fun ifihan ti awọn aimọ ati didi tun ati thawing ni igbaradi ayẹwo; |
| CT>38 | Imudara imudara kekere;PCR ọja ti gun ju;orisirisi lenu irinše ti wa ni degraded |
| Igi ampilifaya laini | Awọn iwadii le jẹ ibajẹ ni apakan nipasẹ awọn iyipo didi-diẹ leralera tabi ifihan gigun si ina |
| Awọn iyato ninu àdáwòkọ iho jẹ paapa ti o tobi | Ojutu idahun ko ni yo patapata tabi ojutu ifa ko dapọ;iwẹ gbona ti ohun elo PCR ti doti nipasẹ awọn nkan Fuluorisenti |
2.5 Nipa data onínọmbà
Onínọmbà data ti qPCR le pin si iwọn iwọn ojulumo ati iwọn pipe.Fun apẹẹrẹ, awọn sẹẹli ninu ẹgbẹ itọju ni akawe pẹlu awọn sẹẹli ninu ẹgbẹ iṣakoso,
Igba melo ni mRNA ti jiini X yipada, eyi jẹ iwọn ti ibatan;ni nọmba kan ti awọn sẹẹli, mRNA ti jiini X
Bawo ni ọpọlọpọ awọn adakọ ti o wa, eyi jẹ titobi pipe.Nigbagbogbo ohun ti a lo pupọ julọ ninu yàrá-yàrá jẹ ọna pipo ojulumo.Nigbagbogbo,ọna 2-ΔΔctti lo pupọ julọ ni awọn idanwo, nitorinaa ọna yii nikan ni yoo ṣafihan ni awọn alaye nibi.
Ọna 2-ΔΔct: Abajade ti o gba ni iyatọ ninu ikosile ti jiini ibi-afẹde ninu ẹgbẹ idanwo ti o ni ibatan si jiini ibi-afẹde ninu ẹgbẹ iṣakoso.O nilo pe awọn imudara imudara ti jiini ibi-afẹde mejeeji ati jiini itọkasi inu wa nitosi 100%, ati pe iyapa ibatan ko yẹ ki o kọja 5%.
Ọna iṣiro jẹ bi atẹle:
Ẹgbẹ iṣakoso Δct = iye ct ti jiini ibi-afẹde ni ẹgbẹ iṣakoso – iye ct ti jiini itọkasi inu ni ẹgbẹ iṣakoso
Ẹgbẹ adanwo Δct = iye ct ti jiini ibi-afẹde ninu ẹgbẹ adanwo – iye ct ti jiini itọkasi inu ninu ẹgbẹ adanwo
ΔΔct = ẹgbẹ idanwo-Δct ẹgbẹ iṣakoso
Ni ipari, ṣe iṣiro ọpọ iyatọ ninu ipele ikosile:
Yi Agbo = 2-ΔΔct (ni ibamu si iṣẹ tayo jẹ AGBARA)
Awọn ọja ti o jọmọ:
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Karun-20-2023
