Ohun elo ibẹrẹ: RNA
Pipo transcription pipo PCR (RT-qPCR) jẹ ọna esiperimenta ti a lo ninu awọn idanwo PCR nipa lilo RNA bi ohun elo ibẹrẹ.Ni ọna yii, lapapọ RNA tabi ojiṣẹ RNA (mRNA) ni a kọkọ kọ sinu DNA ibaramu (cDNA) nipasẹ yiyipada transcriptase.Lẹhinna, iṣesi qPCR kan ni a ṣe ni lilo cDNA bi awoṣe.RT-qPCR ti lo ni ọpọlọpọ awọn ohun elo isedale molikula, pẹlu itupalẹ ikosile pupọ, afọwọsi kikọlu RNA, afọwọsi microarray, wiwa pathogen, idanwo jiini, ati iwadii arun.
Ọkan-igbese ati meji-igbese awọn ọna fun RT-qPCR
RT-qPCR le ṣe aṣeyọri nipasẹ ọna-igbesẹ kan tabi ọna-igbesẹ meji.Igbesẹ RT-qPCR kan daapọ transcription yiyipada ati imudara PCR, gbigba iyipada transscriptase ati DNA polymerase lati pari iṣesi ni tube kanna labẹ awọn ipo ifipamọ kanna.Igbesẹ kan RT-qPCR nikan nilo lilo awọn alakoko kan pato.Ni RT-qPCR-igbesẹ meji, ifasilẹ iyipada ati imudara PCR ni a ṣe ni awọn tubes meji, ni lilo awọn buffers iṣapeye oriṣiriṣi, awọn ipo ifaseyin, ati awọn ilana apẹrẹ alakoko.
| Anfani | Alailanfani | |
| Igbesẹ kan | Ọna yii ko ni aṣiṣe esiperimenta bi awọn aati mejeeji ṣe ni tube kan
Awọn igbesẹ pipe pipe diẹ dinku eewu ti ibajẹ
Dara fun imudara giga-throughput / iboju, yara ati atunṣe | Awọn aati meji-meji ko le ṣe iṣapeye lọtọ
Niwọn igba ti awọn ipo ifasẹyin ti gbogun nipasẹ apapọ iṣesi-igbesẹ meji, ifamọ ko dara bi ti ọna igbesẹ meji.
Nọmba awọn ibi-afẹde ti a rii nipasẹ apẹẹrẹ kan jẹ kekere |
| Igbesẹ Meji | Agbara lati ṣẹda awọn ile-ikawe cDNA iduroṣinṣin ti o le wa ni ipamọ fun awọn akoko pipẹ ati lo ninu awọn aati pupọ
Awọn jiini ibi-afẹde ati awọn jiini itọkasi le jẹ imudara lati ile-ikawe cDNA kanna laisi iwulo fun awọn ile-ikawe cDNA lọpọlọpọ
Awọn buffer ifasẹyin ati awọn ipo ifasẹyin ti o jẹki iṣapeye ti awọn ṣiṣe iṣesi ẹyọkan
Aṣayan iyipada ti awọn ipo okunfa | Lilo awọn ọpọn ọpọn, ati awọn igbesẹ pipetting diẹ sii pọ si eewu ti ibajẹ DNA, ati akoko n gba.
Nilo iṣapeye diẹ sii ju ọna igbese kan lọ |
Awọn ọja ti o jọmọ:
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Igbese Kan) -SYBR Green I
RT-qPCR Easyᵀᴹ (Igbese Kan) -Taqman
RT Easyᵀᴹ I Titunto Premix Fun Iṣagbepọ CDNA Okun-akọkọ
Real Time PCR Easyᵀᴹ-SYBR Green I Kit
Asayan ti lapapọ RNA ati mRNA
Nigbati o ba n ṣe adaṣe idanwo RT-qPCR kan, o ṣe pataki lati pinnu boya lati lo RNA lapapọ tabi mRNA ti a sọ di mimọ bi awoṣe fun iyipada iyipada.Botilẹjẹpe mRNA le ni anfani lati pese ifamọ ti o ga diẹ, lapapọ RNA jẹ ṣi lo nigbagbogbo.Idi fun eyi ni pe lapapọ RNA ni anfani pataki diẹ sii bi ohun elo ibẹrẹ ju mRNA.Ni akọkọ, ilana naa nilo awọn igbesẹ isọdọmọ diẹ, eyiti o ni idaniloju imularada pipo to dara julọ ti awoṣe ati deede deede ti awọn abajade si awọn nọmba sẹẹli ti o bẹrẹ.Ni ẹẹkeji, o yago fun igbesẹ imudara mRNA, eyiti o le yago fun iṣeeṣe awọn abajade skewed nitori awọn imupadabọ oriṣiriṣi ti awọn mRNA oriṣiriṣi.Ìwò, níwọ̀n bí ó ti jẹ́ pé nínú ọ̀pọ̀lọpọ̀ ohun èlò ìfidíwọ̀n ìbátan ti àbùdá ibi-afẹ́fẹ́ ṣe pàtàkì ju ìfara-ẹni-rúbọ pípé ti ìṣàwárí náà, àpapọ̀ RNA dára sí i ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìgbà.
Yiyipada transcription alakoko
Ni ọna meji-igbesẹ, awọn ọna oriṣiriṣi mẹta le ṣee lo lati ṣe afihan iṣesi cDNA: oligo(dT) awọn alakoko, awọn alakoko laileto, tabi awọn alakoko kan pato.Ni deede, awọn alakoko oligo(dT) ati awọn alakoko laileto ni a lo ni apapọ.Awọn alakoko wọnyi fi kun si okun awoṣe mRNA ati pese iyipada transcriptase pẹlu aaye ibẹrẹ fun iṣelọpọ.
| Aṣayan akọkọ | Igbekale ati iṣẹ | Anfani | Alailanfani |
| Oligo(dT) alakoko (tabi oligo(dT) alakoko) | Itẹkun ti o gbooro si awọn iṣẹku thymine ni iru poly(A) ti mRNA;oran oligo(dT) alakoko ni G, C, tabi A ni opin 3′ (ojula oran) | Akopọ ti cDNA gigun ni kikun lati poly(A) -tailed mRNA
Wulo nigbati ohun elo ibẹrẹ kere si wa
Aaye idagiri ṣe idaniloju pe alakoko oligo(dT) sopọ mọ iru 5′ poly(A) ti mRNA | O dara nikan fun imudara awọn Jiini pẹlu awọn iru poly(A).
Gba cDNA gige lati aaye alakoko *2 ni poli(A)
Iyatọ lati dè si opin 3′
*Ṣeṣe yii ti dinku ti o ba lo awọn alakoko oligo(dT) ti a sun |
| alakoko ID
| Awọn ipilẹ 6 si 9 ni gigun, eyiti o le fa si awọn aaye pupọ lakoko gbigbe RNA | Anneal si gbogbo awọn RNA (tRNA, rRNA, ati mRNA)
Dara fun awọn iwe afọwọkọ pẹlu igbekalẹ Atẹle pataki, tabi nigbati ohun elo ibẹrẹ kere si wa
Ikore cDNA ti o ga | cDNA ti yipada lati gbogbo RNA, eyiti a ko fẹ nigbagbogbo ati pe o le di ami ifihan ti mRNA afojusun naa.
gba cDNA ege |
| ọkọọkan-kan pato alakoko | Awọn alakoko aṣa ti o fojusi awọn ilana mRNA kan pato | kan pato cDNA ìkàwé
Mu ifamọ pọ si
Lilo awọn alakoko qPCR yiyipada | Nikan ni opin si iṣelọpọ ti jiini ibi-afẹde kan |
Yiyipada transcriptase
Iyipada transcriptase jẹ enzymu kan ti o nlo RNA lati ṣepọ DNA.Diẹ ninu awọn iwe afọwọkọ yiyipada ni iṣẹ RNase ati pe o le dinku awọn okun RNA ni awọn okun arabara RNA-DNA lẹhin kikọ.Ti ko ba ni iṣẹ enzymatic RNase, RNaseH le ṣe afikun fun ṣiṣe qPCR ti o ga julọ.Awọn enzymu ti o wọpọ pẹlu Moloney murine leukemia virus yiyipada transcriptase ati ọlọjẹ myeloblastoma yiyipada transcriptase.Fun RT-qPCR, o jẹ apẹrẹ lati yan iyipada iyipada pẹlu iwọn otutu ti o ga julọ, ki iṣelọpọ cDNA le ṣee ṣe ni awọn iwọn otutu ti o ga julọ, ni idaniloju transcription aṣeyọri ti awọn RNA pẹlu eto ile-ẹkọ giga ti o ga julọ, lakoko mimu iṣẹ ṣiṣe ni kikun jakejado iṣesi naa, ti o mu abajade cDNA ti o ga julọ.
Awọn ọja ti o jọmọ:
Foreasy M-MLV Yiyipada Transcriptase
RNase H aṣayan iṣẹ-ṣiṣe ti yiyipada transcriptase
RNaseH ni anfani lati dinku awọn okun RNA lati awọn duplexes RNA-DNA, ti o ngbanilaaye iṣelọpọ daradara ti DNA ala-meji.Bibẹẹkọ, nigba lilo mRNA gigun bi awoṣe, RNA le jẹ ibajẹ laipẹ, ti o yọrisi cDNA gedu.Nitorinaa, o jẹ anfani nigbagbogbo lati dinku iṣẹ ṣiṣe RNaseH lakoko cloning cDNA ti o ba fẹ iṣelọpọ awọn iwe afọwọkọ gigun.Ni idakeji, awọn iwe afọwọkọ yiyipada pẹlu iṣẹ RNase H nigbagbogbo jẹ anfani fun awọn ohun elo qPCR nitori pe wọn mu yo ti awọn duplexes RNA-DNA pọ si lakoko iyipo akọkọ ti PCR.
Apẹrẹ akọkọ
Awọn alakoko PCR ti a lo fun igbesẹ qPCR ni RT-qPCR yẹ ki o jẹ apẹrẹ ni apere lati tan kaakiri isunmọ exon-exon, nibiti alakoko imudara le fa aala exon-intron gangan.Níwọ̀n bí a ti jẹ́ kí àwọn ọ̀rọ̀ àbùdá DNA tí ó ní intron tí ó ní àfikún sí i, àpẹrẹ yìí dín ewu àwọn ìdánwò èké tí a pọ̀ sí i láti inú àkópọ̀ DNA jíjẹ-ara-ẹni.
Ti a ko ba le ṣe apẹrẹ awọn alakoko lati yapa awọn exons tabi awọn aala exon-exon, o le jẹ pataki lati tọju awọn ayẹwo RNA pẹlu DNase I tabi dsDNase ti ko ni RNase lati yọkuro ibajẹ DNA jiini.
RT-qPCR Iṣakoso
Iṣakoso odi transcription yiyipada (iṣakoso-RT) yẹ ki o wa ninu gbogbo awọn adanwo RT-qPCR lati ṣawari idoti DNA (bii DNA genomic tabi awọn ọja PCR lati awọn aati iṣaaju).Iṣakoso yii ni gbogbo awọn paati ifaseyin ayafi yiyipada transcriptase.Niwọn igba ti transcription yi pada ko waye pẹlu iṣakoso yii, ti a ba ṣe akiyesi imudara PCR, ibajẹ lati DNA ṣee ṣe julọ.
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹjọ-02-2022
