PCR pipo Fluorescence (ti a tun mọ ni TaqMan PCR, lẹhinna tọka si FQ-PCR) jẹ imọ-ẹrọ pipo nucleic acid tuntun ti o dagbasoke nipasẹ PE (Perkin Elmer) ni Amẹrika ni ọdun 1995. Imọ-ẹrọ yii da lori PCR ti aṣa nipasẹ fifi awọn iwadii aami fluorescent kun.Ti a ṣe afiwe pẹlu PCR rọ, FQ-PCR ni ọpọlọpọ awọn anfani lati mọ iṣẹ pipo rẹ.Nkan yii ni ipinnu lati ṣapejuwe ni ṣoki awọn abuda, awọn ilana, awọn ọna, ati awọn ohun elo ti imọ-ẹrọ.
1 Awọn ẹya ara ẹrọ
FQ-PCR kii ṣe ifamọ giga ti PCR arinrin nikan, ṣugbọn nitori ohun elo ti awọn iwadii fluorescent, o le rii taara iyipada ti ifihan agbara Fuluorisenti lakoko imudara PCR nipasẹ eto imudani fọtoelectric lati gba awọn abajade pipo, eyiti o bori ọpọlọpọ awọn ailagbara ti PCR aṣa, nitorinaa o tun ni pato pato ti hybridization DNA ati imọ-ẹrọ iwoye giga.
Fun apẹẹrẹ, awọn ọja PCR gbogbogbo nilo lati ṣe akiyesi nipasẹ agarose gel electrophoresis ati abawọn ethidium bromide pẹlu ina ultraviolet tabi nipasẹ polyacrylamide gel electrophoresis ati abawọn fadaka.Eyi kii ṣe awọn ohun elo pupọ nikan, ṣugbọn tun gba akoko ati igbiyanju.Awọn abawọn ti a lo Ethidium bromide jẹ ipalara si ara eniyan, ati pe awọn ilana idanwo idiju wọnyi pese awọn anfani fun idoti ati awọn idaniloju eke.Bibẹẹkọ, FQ-PCR nilo lati ṣii ideri lẹẹkanṣoṣo lakoko ikojọpọ ayẹwo, ati pe ilana ti o tẹle jẹ iṣẹ-pipade-tube patapata, eyiti ko nilo ilana-ifiweranṣẹ PCR, yago fun ọpọlọpọ awọn drawbacks ni awọn iṣẹ PCR ti aṣa.Idanwo naa ni gbogbogbo nlo ABI7100 PCR igbona cycler ti o dagbasoke nipasẹ ile-iṣẹ PE.
Ohun elo naa ni awọn abuda wọnyi: ① Ohun elo jakejado: O le ṣee lo fun DNA ati RNA PCR ọja titobi, iwadii ikosile pupọ, wiwa pathogen, ati iṣapeye awọn ipo PCR.② Ilana pipo alailẹgbẹ: Lilo awọn iwadii ti o ni aami fluorescently, iye fluorescence yoo ṣajọpọ pẹlu ọmọ PCR lẹhin itusilẹ laser, lati le ṣaṣeyọri idi ti iwọn.③ Iṣiṣẹ ṣiṣe giga: Ti a ṣe sinu 9600 PCR thermal cycler, kọnputa ti iṣakoso 1 si awọn wakati 2 lati pari imudara ati iwọn ti awọn ayẹwo 96 laifọwọyi ati ni mimuuṣiṣẹpọ.④ Ko si nilo fun gel electrophoresis: Ko si ye lati dilute ati electrophoresis awọn ayẹwo, o kan lo pataki kan ibere lati ri taara ni lenu tube.⑤ Ko si idoti ninu opo gigun ti epo: Iyatọ ti a fi sinu tube ifasilẹ ni kikun ati eto imudani fọtoelectric ni a gba, nitorinaa ko si iwulo lati ṣe aniyan nipa idoti.⑥ Awọn abajade jẹ atunṣe: iwọn iwọn agbara ti o to awọn aṣẹ titobi marun.Nitorinaa, niwọn igba ti imọ-ẹrọ yii ti ni idagbasoke ni aṣeyọri, o ti ni idiyele nipasẹ ọpọlọpọ awọn oniwadi onimọ-jinlẹ ati pe o ti lo ni ọpọlọpọ awọn aaye.
2 Awọn ilana ati awọn ọna
Ilana iṣiṣẹ ti FQ-PCR ni lati lo iṣẹ-ṣiṣe 5′→3′ exonuclease ti Taq henensiamu lati ṣafikun iwadii aami fluorescently si eto ifaseyin PCR.Iwadii le ṣe arabara ni pato pẹlu awoṣe DNA ti o wa ninu ilana alakoko.Awọn 5'ipari ti awọn iwadi ti wa ni ike pẹlu awọn fluorescence itujade jiini FAM (6-carboxyfluorescein, fluorescence itujade tente ni 518nm), ati awọn 3'end ti wa ni ike pẹlu The fluorescence quenching ẹgbẹ TAMRA (6-carboxytetramethylrhodamine, fluorescence ti 3) pro. phosphorylated lati ṣe idiwọ iwadii naa lati faagun lakoko imudara PCR.Nigbati iwadii naa ba wa ni mimule, ẹgbẹ quencher dinku itujade fluorescence ti ẹgbẹ ti njade.Ni kete ti ẹgbẹ ti njade ti yapa kuro ninu ẹgbẹ quenching, idinamọ naa ti gbe soke, ati iwuwo opiti ni 518nm pọ si ati pe o rii nipasẹ eto wiwa fluorescence. Ni akoko isọdọtun, iwadii naa hybridizes pẹlu DNA awoṣe, ati Taq henensiamu ninu apakan itẹsiwaju n gbe pẹlu awoṣe DNA pẹlu itẹsiwaju ti alakoko.Nigbati a ba ge iwadii naa kuro, ipa ipaniyan yoo tu silẹ ati pe ifihan Fuluorisenti ti tu silẹ.Ni gbogbo igba ti awoṣe ba ti daakọ, a ge iwadii kan kuro, pẹlu itusilẹ ti ifihan agbara Fuluorisenti.Niwọn igba ti ibatan ọkan-si-ọkan wa laarin nọmba awọn fluorophores ti a tu silẹ ati nọmba awọn ọja PCR, ilana yii le ṣee lo lati ṣe iwọn awoṣe deede.Ohun elo idanwo gbogbogbo nlo ABI7100 PCR igbona cycler ti o dagbasoke nipasẹ ile-iṣẹ PE, ati pe awọn cyclers igbona miiran tun le ṣee lo.Ti o ba ti lo ABI7700 iru ifaseyin eto fun ṣàdánwò, lẹhin ti awọn lenu ti wa ni ti pari, awọn pipo esi le wa ni taara fun nipasẹ kọmputa onínọmbà.Ti o ba lo awọn cyclers igbona miiran, o nilo lati lo aṣawari fluorescence lati wiwọn ifihan agbara fluorescence ninu tube ifaseyin ni akoko kanna lati ṣe iṣiro RQ+, RQ-, △RQ.RQ + duro ni ipin ti awọn luminescence kikankikan ti awọn Fuluorisenti itujade Ẹgbẹ ti awọn sample tube si awọn luminescence kikankikan ti awọn quenching ẹgbẹ, RQ- duro awọn ipin ti awọn meji ninu awọn òfo tube, △RQ (△RQ=RQ + -RQ-) duro iye ti fluorescence esi ti o le gba nigba PC.Nitori iṣafihan awọn iwadii Fuluorisenti, iyasọtọ ti idanwo naa ni ilọsiwaju ni pataki.Apẹrẹ iwadii yẹ ki o pade awọn ipo wọnyi ni gbogbogbo: ① Gigun ti iwadii yẹ ki o jẹ awọn ipilẹ 20-40 lati rii daju pe pato ti abuda.②Akoonu ti awọn ipilẹ GC wa laarin 40% ati 60% lati yago fun ẹda-iwe ti awọn ilana nucleotide ẹyọkan.③ Yago fun isodipupo tabi ni lqkan pẹlu awọn alakoko.④ Iduroṣinṣin ti awọn abuda laarin awọn iwadii ati awoṣe jẹ tobi ju iduroṣinṣin ti awọn abuda laarin alakoko ati awoṣe, nitorina iye Tm ti ibere yẹ ki o wa ni o kere ju 5 ° C ju iye Tm ti alakoko lọ.Ni afikun, ifọkansi ti iwadii, homology laarin iwadii ati ilana awoṣe, ati aaye laarin iwadii ati alakoko gbogbo ni ipa lori awọn abajade esiperimenta.
Awọn ọja ti o jọmọ:
China Real Time PCR Easyᵀᴹ-Taqman Olupese ati Olupese |Foregene (foreivd.com)
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹwa 15-2021
