RT-qPCR jẹ idanwo ipilẹ ti isedale molikula, ati pe gbogbo eniyan gbọdọ faramọ pẹlu rẹ.Ni akọkọ pẹlu awọn igbesẹ mẹta: isediwon RNA, yiyipada transcription sinu cDNA, ati PCR pipo Fuluorisenti gidi-gidi.Ko ṣe iranlọwọ, kini o n ṣẹlẹ?O jẹ seese wipe o wa ni a isoro pẹluadanwo transcription yiyipada!Botilẹjẹpe o dabi pe idanwo transcription yiyipada nilo lati ṣafikun RNA, dNTP, awọn alakoko, atiyiyipada transcriptasesi tube centrifuge ati ki o dapọ daradara, ṣugbọn ninu ilana ṣiṣe gangan, awọn alaye pupọ tun wa ti o nilo lati san ifojusi si.Jẹ ki a kọ ẹkọ nipa rẹ!

Bawo ni lati ṣe idajọ didara RNA?
Lati gba cDNA, didara RNA jẹ pataki!Didara RNA le ṣee wa ni akọkọ lati awọn aaye meji:
(1) Iduroṣinṣin RNA:Iduroṣinṣin RNA le jẹri nipasẹ agarose gel electrophoresis. Gbigba awọn eukaryotes gẹgẹbi apẹẹrẹ, RNA ti o pe ni awọn ẹgbẹ mẹta ti o han kedere, awọn iwuwo molikula lati nla si kekere jẹ 28S, 18S, ati 5S, ati 28S jẹ imọlẹ lemeji bi 18S;ti o ba ti mẹta igbohunsafefe le ri, ṣugbọn awọn iye iru ti wa ni gaara tabi Itankale tumo si wipe RNA ti wa ni die-die degraded.Ni akoko yii, jọwọ ṣe ifasẹyin iyipada lẹsẹkẹsẹ ki o mu igbewọle awoṣe pọ si ni deede;ti o ba jẹ pe ẹgbẹ kan nikan ti o ni iwuwo molikula kekere tabi ko si iye ti a le rii, RNA ti bajẹ patapata ati pe o nilo lati tun fa jade.Agilent 2100 tọkasi iṣotitọ RNA pẹlu aworan atọka ti o ga julọ ati iye RIN.Ti acid nucleic ba wa ni pipe, ipilẹ ti electropherogram jẹ alapin;ti acid nucleic ba ti bajẹ pupọ, ipilẹ jẹ aiṣedeede ati pe awọn oke ibajẹ diẹ sii han;iye RIN ṣe afihan iṣotitọ ti RNA, laarin iwọn 0-10, iye ti o tobi julọ, didara RNA dara julọ.O dara, iwọn pipe ti o ga julọ.
(2) Mimo ti RNA:Ipin ti OD260/280 le ṣee wa-ri nipasẹ UV spectrophotometry.Ti ipin OD260/280 ba wa laarin 1.9 ati 2.1, mimọ dara pupọ.
DNA genomic ti o ku le ja si awọn abajade pipo ti ko pe
Nigbati RNA ba jade, RNA ti a gba le jẹ idapọ pẹlu DNA jiini (gDNA) ti a ko ti sọ di mimọ.Nitoribẹẹ, cDNA lẹhin isọdọtun yiyipada yoo tun dapọ pẹlugDNA.Nigba ibosileqPCRlenu,cDNAati gDNA le ni alekun nigbakanna, ti o mu abajade iye CT kekere kan, nitorina awọn abajade le jẹ abosi.
Nitorina kini o yẹ ki a ṣe ni ipo yii?Foregeneni imọran:
(1) Ṣe itọju genomisi lori RNA ti o yipada, eyiti o le yọkuro nipasẹ isediwon iwe lakoko isediwon RNA;
(2) Ṣe itọju RNA ti a fa jade pẹlu DNAseI , ṣugbọn fopin si pẹlu EDTA;
ti yiyipada transcription reagentspẹlu awọn modulu imukuro genome;

Bii o ṣe le yan awọn alakoko fun transcription yiyipada?
Awọn alakoko transcription yiyipada tun ni ipa lori abajade ti ifaseyin transcription.O le yan awọn alakoko laileto, Oligo dT tabi awọn alakoko kan pato-jiini fun iyipada iyipada ni ibamu si awọn ipo kan pato ti idanwo naa:
(1) Awọn iwe afọwọkọ pato: Jiini-kan pato alakoko ti wa ni niyanju;
(2) Awọn iwe afọwọkọ ajẹkù gigun: Oligo dT / gene-kan pato awọn alakoko ni a ṣe iṣeduro;
(3) Awọn ajẹkù inu ti awọn iwe afọwọkọ gigun-gun: Jiini-kan pato alakoko / ID alakoko / ID alakoko + Oligo dT.Ti o ba jẹ pe a ṣe idanwo qPCR ti o tẹle, Oligo dT ko le ṣee lo nikan, nitori lilo Oligo dT nikan le fa 3' opin irẹwẹsi, ti o yori si awọn esi idanwo qPCR ti ko tọ;
(4) miRNA: Awọn alakoko Stem-loop tabi awọn alakoko tailing le ṣee lo.

Awọn akoko melo ni o yẹ ki cDNA ọja transcription pada wa ni ti fomi fun titobi bi?
Lẹhin gbigba cDNA ti ọja transcription, iye igba ti cDNA yẹ ki o fomi fun awọn adanwo qPCR jẹ pataki pupọ.Ti ifọkansi cDNA ba ga ju tabi lọ silẹ, ṣiṣe imudara le ni ipa.Njẹ ifọkansi cDNA le ṣe iwọn, ati bawo ni o ṣe yẹ?
(1) Ifojusi cDNA ti ọja transcription yiyipada ko le ṣe iwọn, nitori ni afikun si ọja cDNA, ọja ifasilẹ pada tun ni Buffer transcription residual, yiyipada transcriptase, awọn alakoko, ati bẹbẹ lọ, eyiti yoo dabaru pẹlu awọn abajade wiwọn ifọkansi ati fa OD260/280, OD260/230D ko ṣe afihan abn.Ni akoko yii, diẹ ninu awọn ọrẹ yoo sọ pe, lẹhinna Emi yoo ṣe iwọn ifọkansi lẹhin iwẹnumọ;Nibi, Foregene yoo fẹ lati leti pe cDNA ko ṣe iṣeduro lati sọ di mimọ, nitori gigun ti cDNA ti o gba nipasẹ iyipada yatọ, ati pe cDNA kukuru yoo sọnu ni isọdọmọ.
(2) Nitorina kini lati ṣe?Ṣaaju idanwo qPCR, itọsi dilution ti cDNA ni a le pinnu nipasẹ idanwo iṣaaju.Fun apẹẹrẹ: lo ojutu ọja iṣura cDNA, dilution 10-fold, ati 100-fold dilution bi awọn awoṣe fun awọn adanwo qPCR, ki o yan ifosiwewe dilution pẹlu iye CT kan ni iwọn 18-28.

Bawo ni o ṣe yẹ ki awọn miRNA yi pada bi?
miRNA jẹ RNA moleku kekere ti o ni okun-ẹyọkan pẹlu iwọn ti o to 22 nt ti ko ṣe koodu fun amuaradagba.Nitori gigun kukuru rẹ, ọna qPCR aṣa jẹ soro lati ṣe iwọn taara, nitorinaa o jẹ pataki nigbagbogbo lati faagun miRNA;Awọn ọna ifasilẹyin ti o wọpọ ti a lo fun miRNA pẹlu ọna-lupu ati ọna iru.
Ọna-lupu stem ni lati fa miRNA naa pọ si nipa fifi awọn alakoko sii-lupu kun.Ọna wiwa yii ni ifamọ ti o ga julọ ati pato, ṣugbọn wiwa wiwa jẹ kekere.Iyipada iyipada kan le rii miRNA kan nikan ati itọkasi inu;ọna fifi iru iru jẹ ti meji O ti pari nipasẹ iṣẹ apapọ ti awọn enzymu meji, eyiti o jẹ PolyA polymerase ati yiyipada transcriptase.PolyA polymerase jẹ iduro fun fifi awọn iru PolyA kun si miRNA lati mu gigun rẹ pọ si, ati yiyipada transcriptase ṣe ifasilẹ transcription.Ọna yii ni wiwa wiwa giga ati pe o le rii ọpọlọpọ awọn miRNAs ati awọn itọkasi inu ninu iwe-kikọ yiyipada kan, ṣugbọn ifamọ ati pato jẹ kekere ni ọna-yipo.