Gbogbo eniyan n sọrọ nipa ilana ti idanwo qRT-PCR, apẹrẹ alakoko, itumọ abajade, ati bẹbẹ lọ, ṣugbọn Mo ro pe o yẹ ki n pin pẹlu rẹ iṣẹ esiperimenta ti qRT-PCR.O jẹ kekere, ṣugbọn o jẹ nipa awọn abajade.
Ṣaaju ṣiṣe qRT-PCR, a nilo lati ni oye ti RNA tiwa ati awọn ọna ṣiṣe.Lẹhinna, awọn akitiyan wa ni ifọkansi lati gba awọn abajade, dipo kiki adaṣe.Nitorinaa ṣaaju ṣiṣe qRT-PCR, a nilo lati pinnu awọn ọran wọnyi (diẹ ninu eyiti o kan si SYBR nikan).
1 Ṣe o da ọ loju pe RNA rẹ ko bajẹ?
NanoDrop 2000 le rii ifọkansi ati mimọ ti RNA nikan, ṣugbọn ko le rii iduroṣinṣin ti RNA.
Iye RNA (Nọmba Intesity RNA) le ṣe afihan iduroṣinṣin ti RNA, eyiti a rii nipasẹ eto Agilent 2100 Bioanalyzer.
Aworan. Aworan atọka ti awọn iye RIN fun oriṣiriṣi awọn ayẹwo RNA (eukaryotes)
Sibẹsibẹ, awọn ile-iwosan gbogbogbo ko ni Agilent 2100 Bioanalyzer.Ni ọran yii, a le rii nipasẹ jeli formaldehyde, ṣugbọn ibeere fun iye lapapọ ti RNA ga, nitorinaa ọna ti o yara ju ni lati lo gel electrophoresis lasan.O nilo lati wa ni agbegbe ti ko ni nuclease, nitorinaa o jẹ dandan lati fi omi ṣan ojò electrophoresis, igo sol, akọmọ gel ati comb pẹlu omi DEPC.Agarose tun jẹ ọfẹ-ọfẹ (niwọn igba ti o ti ṣii tuntun), ati Ifipamọ Loading yẹ ki o ṣii tuntun bi o ti ṣee ṣe, pẹlu gel 1.2%.
Ṣe akiyesi pe gel gbọdọ wa ni tituka patapata, bibẹẹkọ o yoo fa awọn ẹgbẹ inhomogeneous, bi a ṣe han ni apẹẹrẹ 9 ni nọmba.Ti foliteji ba ga ju tabi ṣiṣiṣẹ fun pipẹ pupọ yoo ṣe ina ooru ati fa ibajẹ RNA, nitorinaa foliteji ati akoko yẹ ki o ṣakoso ni deede.Ni afikun, iṣiṣẹ gel tun le pinnu siwaju sii boya iyọku DNA wa ninu ayẹwo, ati rii boya nọmba nla ti awọn ẹgbẹ ti o da duro wa ni fifunni daradara.
Olusin.Gel electrophoresis erin ti RNA
2 Ṣe o da ọ loju nipa ifọkansi ti cDNA rẹ?
Iriri ti awọn arakunrin nla ni ile-iyẹwu ni pe cDNA ti eto 20 ul ti o gba nipasẹ iyipada kọọkan jẹ diluted 20X taara, lakoko ti awọn arabinrin post-doctoral ti fomi 10X.Mo maa dale lori ipo naa.Nitoripe didara RNA ti a mẹnuba nipasẹ eniyan kọọkan yatọ, ipele ti iyipada tun yatọ, ati pe imọ-ẹrọ iyipada le ma duro.
Nitorinaa ni gbogbo igba ti MO ba gba cDNA ti o yi pada, Emi yoo kọkọ dilute rẹ ni bii awọn akoko 3, ati lẹhinna lo jiini itọju ile lati ṣe RT-PCR, nọmba awọn yiyi jẹ awọn iyipo 25 ni gbogbogbo, lati ṣe idanimọ ifọkansi kan pato, ati lẹhinna pinnu ifosiwewe dilution ikẹhin.
3 Ṣe o da ọ loju pe awọn alakoko rẹ rọrun lati lo?
O le kọja ọna yo ti qRT-PCR, ṣugbọn eyi tun jẹ owo.Fun awọn ile-iṣere laisi owo pupọ, nigbati wọn gba ọpọlọpọ awọn alakoko, wọn le lo RT-PCR arinrin lati rii boya o jẹ ẹgbẹ kan ati ṣe idanimọ pato ti awọn alakoko.Ti o ba ti yàrá ni ko kukuru ti owo, awọn pato ti gbogbo awọn alakoko le ti wa ni damo ni kete ti nipasẹ awọn yo ti tẹ.
4 Ṣe o da ọ loju pe awọn ipo idanwo rẹ dara?
SYBR yẹ ki o ni aabo lati ina to lagbara, nitorinaa gbiyanju lati pa ina loke nigbati o ba nfi reagenti SYBR kun, ati pe o nilo lati lo ina didin nikan lati pari.
Tọju SYBR ni 4°C.Nigbati o ba wa ni lilo, rọra yipada si oke ati isalẹ lati dapọ daradara lati yago fun foaming, ma ṣe yiyi ni agbara.
Diẹ ninu awọn arabinrin fẹ lati fa awọn ami si ori igbimọ PCR nitori iberu ti dapọ awọn ayẹwo, eyiti ko tọ.Nitoripe awọn asami rẹ ṣeese lati kan ikojọpọ awọn ifihan agbara Fuluorisenti, Mo ṣeduro gbogbogbo fun awọn ọdọ lati lo awọn iwe ajako idanwo lati ṣe iranlọwọ ni iranti, bi a ṣe han ni isalẹ.
Olusin.qRT-PCR apẹẹrẹ ikojọpọ aworan atọka
5 Ṣe o da ọ loju pe o n ṣe o tọ?
Rii daju lati wọ awọn ibọwọ, wọ awọn ibọwọ, wọ awọn ibọwọ, ati sọ awọn nkan pataki ni igba mẹta.
Lati le dinku ifihan ti SYBR si ina, Emi tikalararẹ fẹ lati ṣafikun awoṣe ni akọkọ, bi o ṣe han ninu nọmba ni isalẹ.Gẹgẹbi iriri, afikun ti iwọn kekere ti awoṣe le fa awọn aṣiṣe iṣapẹẹrẹ.Nitorina, lati le dinku aṣiṣe ti o ṣẹlẹ nipasẹ fifi iwọn kekere ti awoṣe kun, Mo maa n ṣe ilọpo meji ayẹwo lẹẹkansi, ati ilọpo meji iye nigbati o ba nfi ayẹwo lati dinku iye H2O2 ti a fi kun.
Olusin.Aworan atọka ti ikojọpọ qRT-PCR
Lẹhinna tunto eto qRT-PCR bi atẹle.
Olusin.qRT-PCR eto igbaradi aworan atọka
AKIYESI: Ilana iṣeto ni lati ṣe lori yinyin.
Lẹhin fifi awọn ayẹwo, lẹẹmọ awọn sihin lilẹ fiimu.Gbiyanju lati ma fi ọwọ kan dada ti fiimu ifasilẹ sihin pẹlu ọwọ rẹ, kan ṣiṣẹ lati aaye ni ẹgbẹ mejeeji ti fiimu naa.Nitori awọn ika ọwọ le tun kan ikojọpọ awọn ifihan agbara Fuluorisenti.Lẹhinna lo centrifuge kan lati yara centrifuge fun awọn iṣẹju 10 ni iyara kekere lati ṣe idiwọ ayẹwo lati adiye lori ogiri.
Awọn ọja ti o jọmọ:
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹrin Ọjọ 28-2023
