Specificity ti erin
Ni ọpọlọpọ igba, idi ti apẹrẹ alakoko ni lati mu iwọn PCR pọ si.Eyi ni ipinnu nipasẹ diẹ sii tabi kere si ipa asọtẹlẹ ti ọpọlọpọ awọn oniyipada.Ọkan pataki oniyipada ni ọkọọkan ni 3'ipari ti alakoko.
Ni pataki, awọn igbelewọn PCR ti a ṣe apẹrẹ fun pato ni o ṣeeṣe lati ṣetọju ṣiṣe giga lori iwọn agbara jakejado, nitori idanwo naa ko ṣe agbejade awọn ọja imudara ti kii ṣe pato, nitorinaa ti njijadu pẹlu awọn reagents PCR tabi ṣe idiwọ ifura imudara akọkọ.
Nitoribẹẹ, ni awọn igba miiran, pato kii ṣe pataki julọ, fun apẹẹrẹ, nigbati ibi-afẹde ni lati ṣe iwọn awọn ibatan ti o ni ibatan ṣugbọn awọn ọlọjẹ oriṣiriṣi, apẹrẹ pataki, iṣapeye ati awọn iṣedede ijẹrisi nilo.
Iwọn yo jẹ ọna boṣewa fun ṣiṣe ayẹwo ni pato ti awọn amplicon, o kere ju ni awọn ofin boya lati mu ibi-afẹde kan pọ si.Sibẹsibẹ, o gbọdọ wa ni tẹnumọ pe awọn iyipo yo le jẹ ṣina nitori, fun apẹẹrẹ, wọn le ni ipa nipasẹ awọn ipa apapọ ti awọn alakoko suboptimal ati awọn ifọkansi awoṣe kekere.
P5 |Yiyọ ti tẹ fihan awọn iyipada Tm ti a gba lati awọn iwari meji ti awọn iye oriṣiriṣi ti awọn DNA afojusun meji.
A. Ni awọn ifọkansi ti o ga julọ (ipolowo)), ko si dimer alakoko ti o han gbangba lẹhin wiwọn qPCR ti pari.Bi ifọkansi awoṣe ti dinku si awọn ẹda 50 (e), ọja ti kii ṣe pato bẹrẹ lati han ati di ọja nikan ni ifọkansi ti o kere julọ (f).
B. Idanwo naa ṣe igbasilẹ Tms kanna ni gbogbo awọn ifọkansi ibi-afẹde, ati pe ko si dimer alakoko ti o han gbangba paapaa ni ifọkansi ti o kere julọ (awọn ẹda 5).Nigba lilo awọn ọna wiwa meji wọnyi, ko si awọn ọja imudara ni a rii ni awọn NTC.
P5 ṣe afihan awọn iyipo itu ti a gba pẹlu awọn apẹẹrẹ ninu eyiti awoṣe wa ni awọn ifọkansi oriṣiriṣi.P 5a fihan pe ni awọn ifọkansi meji ti o kere julọ, Tms ti awọn ọja imudara ti kii ṣe pato ti a ṣe ni o kere ju ti awọn amplicons pato.
O han ni, ọna wiwa yii ko le ṣee lo ni igbẹkẹle lati ṣawari awọn ibi-afẹde ti o wa ni awọn ifọkansi kekere.
O yanilenu, awọn NTC, ie, awọn ayẹwo ti ko si DNA rara, ko ṣe igbasilẹ (ti kii ṣe pato) awọn ọja imudara, ti o nfihan pe DNA genomic lẹhin le ṣe alabapin ninu imudara/polymerization ti kii ṣe pato.
Nigba miiran iru awọn alakoko abẹlẹ ati imudara ti kii ṣe pato ko le ṣe atunṣe, ṣugbọn o ṣee ṣe nigbagbogbo lati ṣe apẹrẹ ọna wiwa ti ko ni imudara ti kii ṣe pato ni ifọkansi awoṣe eyikeyi ati NTC (P 5b).
Nibi, paapaa gbigbasilẹ ampilifaya ti ifọkansi ibi-afẹde pẹlu Cq kan ti 35 yoo ṣe agbejade titẹ itu kan pato.Bakanna, awọn NTC ko ṣe afihan awọn ami ti imudara ti kii ṣe pato.Nigba miiran, ihuwasi wiwa le dale lori ọti iya, ati pe iṣamulo ti kii ṣe pato nikan ni a rii ni awọn akojọpọ ifipamọ kan, eyiti o le ni ibatan si awọn ifọkansi Mg2+ oriṣiriṣi.
Iduroṣinṣin ti erin
Imudara ti Ta jẹ igbesẹ ti o wulo ni iṣeduro idaniloju ati ilana imudara ti iṣawari qPCR.O pese itọkasi taara ti agbara ti alakoko ti a ṣeto nipasẹ fifihan iwọn otutu (tabi iwọn otutu) ti o ṣe agbejade Cq ti o kere julọ laisi imudara NTC.
Iyatọ meji si mẹrin ni ifamọ le ma ṣe pataki fun awọn eniyan ti o ni ikosile mRNA giga, ṣugbọn fun awọn idanwo iwadii, o le tumọ iyatọ laarin rere ati awọn abajade odi eke.
Awọn ohun-ini Ta ti awọn alakoko qPCR le yatọ pupọ.Diẹ ninu awọn idanwo ko lagbara pupọ, ati pe ti wọn ko ba ṣe labẹ iye Ta ti aipe ti awọn alakoko, wọn yoo ṣubu ni kiakia.
Eyi ṣe pataki nitori iru wiwa yii nigbagbogbo jẹ iṣoro ni agbaye gidi, ati mimọ ti ayẹwo, ifọkansi DNA, tabi wiwa DNA miiran le ma dara julọ.
Ni afikun, nọmba ẹda ibi-afẹde le yatọ ni iwọn jakejado, ati awọn reagents, awọn ohun elo ṣiṣu, tabi awọn ohun elo le yatọ si awọn ti a lo nigbati o ṣeto idanwo naa.
P6|Iwọn iwọn otutu ṣe afihan oriṣiriṣi agbara ti iṣawari PCR.
A. Lo Bioline's Sensifast SYBR mastermix (nọmba katalogi BIO-98050) lati ṣe PCR lori cDNA ti a pese sile lati ọpọlọ eniyan RNA.
B. Lo ohun-elo Bio-Rad's CFX qPCR lati ṣe igbasilẹ maapu ampilifaya ati ọna itu ti apalene (NM_033207, F: GCCATGGAGGAAAGTGACAGACC, R: CTCATGTGTGGTGATCTCCTAGG).
C. Aworan ampilifaya ati yiyo ti ACSBG1 (NM_015162.4, F: CTACACTTCCGGCACCACTGG, R: GTCCACGTGATATTGCTCTGACTCAG).
D. Aworan ampilifaya ati ọna itu ti GFAP (NM_002055.5, F: TGGAGAGGAAGATTGAGTCGCTGG, R: CGAACCTCCTCCTCGTGATCTTC).
E. Cqs ti a gbasilẹ ni oriṣiriṣi awọn iwọn otutu annealing, nfihan iyatọ ninu Cq ti o gbasilẹ labẹ iwọn otutu 7C.
P 6 ṣe afihan abajade aṣoju ti idanwo ti ko fẹ, nibiti a ti ṣe qPCR nipa lilo gradient Tas laarin 59C ati 67C (P 6a), ni lilo awọn alakoko fun awọn jiini-ọpọlọ eniyan mẹta.
O le rii lati awọn aworan ampilifaya pe awọn alakoko Opalin jina si apẹrẹ nitori iwọn Ta ti o dara julọ jẹ dín pupọ (olusin 6b), iyẹn ni, awọn Cqs ti tuka kaakiri, ti o mu ki awọn Cqs ni pataki ni akawe si Cqs Low ti aipe wọn.
Ọna wiwa yii jẹ riru ati pe o le ja si imudara suboptimal.Nitorina, bata ti awọn alakoko yẹ ki o tun ṣe.Ni afikun, itusilẹ ti o yo (inset) fihan pe pato ti ọna wiwa yii le tun jẹ iṣoro, nitori iṣipopada ti Ta kọọkan yatọ.
Ọna wiwa ACSBG1 ti o han ni P 6c lagbara ju ọna wiwa Opalin lọ loke, ṣugbọn o tun jina si apẹrẹ, ati pe o ṣee ṣe pe o le ni ilọsiwaju.
Bibẹẹkọ, a tẹnumọ pe ko si asopọ pataki laarin agbara ati pato, nitori ọna itu ti a ṣe nipasẹ ọna wiwa yii fihan iye tente oke kanna ni gbogbo Tas (inset).
Ni ida keji, idanwo agbara jẹ ifarada pupọ diẹ sii, ṣiṣe awọn Cqs ti o jọra ni ọpọlọpọ Tas, bi ninu idanwo GFAP ti o han ni P 6d.
Iyatọ ti o wa ninu Cqs ti o gba ni iwọn 8 iwọn Celsius kanna jẹ kere ju 1, ati itusilẹ ti tẹ (inset) jẹrisi awọn abuda wiwa ni iwọn otutu yii.O tọ lati ṣe akiyesi pe Tas iṣiro ati ibiti Ta gangan le jẹ iyatọ pupọ.
Ọpọlọpọ awọn itọnisọna ti a ṣe lati ṣe iranlọwọ fun awọn oniwadi ṣe apẹrẹ awọn alakoko ti o dara, julọ ti o da lori awọn ofin ti o gun-igba pipẹ ati pe a ti san ifojusi pupọ si 3'end ti awọn alakoko.Nigbagbogbo a ṣe iṣeduro lati ṣafikun G tabi C ni opin 3' ati awọn ipilẹ G tabi C meji (dimole GC), ṣugbọn ko ju meji ninu awọn ipilẹ 5 kẹhin.
Ni iṣe, awọn ofin wọnyi le ṣe itọsọna awọn oniwadi, ṣugbọn wọn ko ṣe deede ni gbogbo awọn ipo.
P7 |Awọn 3'ipari ti alakoko ni ipa diẹ lori pato tabi ṣiṣe.
A. Awọn ipo ti awọn alakoko fun eda eniyan HIF-1a (NM_181054.2) pupọ.
B. Lo Agilent Brilliant III SYBR Green iya oti (Cat. No. 600882) lati mu awọn ohun idanwo mẹfa pọ si.
C. Amplification graph ati yo ti gbasilẹ nipasẹ Bio-Rad's CFX qPCR irinse ati 3′end alakoko.Awọn NTC ti han ni pupa.
D. Cqs igbasilẹ ti kọọkan igbeyewo ohun kan
Fun apẹẹrẹ, abajade ni P 7 tako ofin 3'end.Gbogbo awọn aṣa gbejade ni ipilẹ awọn abajade kanna, pẹlu awọn akojọpọ alakoko meji ti o yori si imudara ti kii ṣe pato ni NTC.
Sibẹsibẹ, a ko le ṣe atilẹyin ipa ti agekuru GC, nitori ninu ọran yii, lilo A tabi T bi o pọju awọn ipilẹ 30 ko dinku pato.
Idanwo C, nibiti F alakoko pari ni GGCC, ṣe igbasilẹ Cqs ni awọn NTC, ti o fihan pe ọkan le fẹ lati yago fun awọn ilana wọnyi ni 30-opin.A tẹnu mọ pe ọna kan ṣoṣo lati pinnu ọkọọkan 3′end ti o dara julọ ti bata alakoko ni lati ṣe iṣiro diẹ ninu awọn alakoko oludije ni idanwo.
Imudara imudara
Ni pataki, botilẹjẹpe wiwa PCR ti kii ṣe pato ko le di pato, imudara imudara le jẹ tunṣe ati pọ si ni ọpọlọpọ awọn ọna oriṣiriṣi nipasẹ yiyipada henensiamu, ọti iya, awọn afikun, ati awọn ipo gigun kẹkẹ.
Lati ṣe iṣiro ṣiṣe ti wiwa PCR, o dara julọ lati lo dilution ni tẹlentẹle ti 10 tabi 5 ni akoko ibi-afẹde nucleic acid, iyẹn ni, “ọna ti tẹ boṣewa”.
Ti a ba lo awọn amplicons PCR tabi awọn ibi-afẹde DNA sintetiki lati ṣe ipilẹṣẹ titẹ boṣewa, awọn itọka ni tẹlentẹle ti awọn ibi-afẹde wọnyi yẹ ki o dapọ pẹlu iye igbagbogbo ti DNA lẹhin (bii DNA jiini).
P8 |Dilution ti tẹ lati ṣe iṣiro ṣiṣe ti PCR.
A. Lo awọn alakoko fun HIF-1: F: AAGAACTTTTAGGCCGCTCA ati R: TGTCCTGTGGTGACTTGTCC ati Agilent's Brilliant III SYBR Green mastermix (nọmba katalogi 600882) fun PCR ati awọn ipo iṣuwọn yo.
B. 100 ng RNA ti wa ni ifasilẹ, ti fomi ni igba 2, ati awọn ayẹwo cDNA ti a fo ni tẹlentẹle ni a fo ni igba 5 si 1 ng DNA genomic eniyan.Awọn yo ti tẹ ti han ni inset.
C. Idahun RT, dilution, ati dilution tẹlentẹle ni a tun ṣe fun ayẹwo cDNA keji, ati awọn abajade jẹ iru.
P 8 ṣe afihan awọn igbọnwọ boṣewa meji, ni lilo ọna wiwa kanna lori awọn ayẹwo cDNA meji ti o yatọ, abajade jẹ ṣiṣe kanna, nipa 100%, ati pe iye R2 tun jẹ iru, iyẹn ni, iwọn ibamu laarin data esiperimenta ati laini ipadasẹhin tabi Ipele data ti linearity.
Awọn iwọn wiwọn meji jẹ afiwera, ṣugbọn kii ṣe deede kanna.Ti idi naa ni lati ṣe iwọn ibi-afẹde ni deede, o gbọdọ ṣe akiyesi pe ko ṣe itẹwọgba lati pese iṣiro nọmba ẹda kan laisi ṣiṣe alaye aidaniloju naa.
P9 |Aidaniloju wiwọn ti o ni nkan ṣe pẹlu titobi nipa lilo ọna ti o yẹ.
A. Lo awọn alakoko fun GAPDH (NM_002046) lati ṣe PCR ati awọn ipo iṣuwọn.F: ACAGTTGCCATGTAGACC ati R: TAACTGGTTGAGCACAGG ati Bioline's Sensifast SYBR mastermix (nọmba katalogi BIO-98050).
B. Apẹrẹ imudara, iyipo yo ati ọna kika boṣewa ti o gbasilẹ pẹlu ohun elo Bio-Rad's CFX qPCR.
C. Standard ti tẹ awonya ati 95% igbekele aarin (CI).
D. Nọmba ẹda naa ati aarin 95% igbẹkẹle ti awọn iye Cq mẹta ti o yọri lati ibi-dilution.
P 9 fihan pe fun idanwo iṣapeye, iyipada atorunwa ti iṣipopada boṣewa kan jẹ isunmọ awọn akoko 2 (95% aarin igbẹkẹle, o kere ju si iwọn), eyiti o le jẹ iyipada ti o kere julọ ti o le nireti.
Ọja ti o jọmọ:
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹsan-30-2021
