Sterilization ti pipette awọn italolobo ati EP tubes, ati be be lo.

1. Mura 0.1% (ẹgbẹrun kan) DEPC (nkan ti o majele pupọ) pẹlu omi ti a ti sọ diionized, lo daradara ni hood fume, ki o si fi pamọ si 4 ° C kuro lati ina;

Omi DEPC jẹ omi mimọ ti a mu pẹlu DEPC ati sterilized nipasẹ iwọn otutu giga ati titẹ giga.Idanwo lati ni ominira ti RNase, DNAse ati proteinase.

2. Fi ipari pipette ati tube EP sinu 0.1% DEPC, ki o si rii daju pe ipari pipette ati tube EP ti kun pẹlu 0.1% DEP.

3. Dabobo lati ina, jẹ ki duro, moju (12-24h)

4. Apoti ti o ni awọn sample ati EP tube ko nilo lati fi sinu DEPC.Lẹhin yiyọ omi DEPC ni aijọju ni sample tabi tube EP, gbe e soke ki o fi ipari si.

5. 121 iwọn Celsius, 30min

6.180 iwọn Celsius, gbẹ fun awọn wakati pupọ (o kere ju wakati 3)

Akiyesi: a.Wọ awọn ibọwọ latex ati awọn iboju iparada nigba mimu DEPC mu!b, tabi laisi sterilization DEPC, 130 ℃, 90min autoclave (ọpọlọpọ awọn ile-iwadi iwọn otutu giga lẹẹmeji)

RNA isediwon ero

Awọn iṣẹlẹ pataki meji ti ikuna ipinya RNA àsopọ

Ibajẹ RNA ati awọn iṣẹku ti awọn aimọ ninu awọn tisọ,nipa ibajẹ, jẹ ki a kọkọ wo idi ti RNA ti a fa jade lati awọn sẹẹli ti o gbin ko ni irọrun bajẹ.Awọn reagenti isediwon RNA ti o wa tẹlẹ gbogbo ni awọn paati ti o ṣe idiwọ RNase ni iyara.Fi lysate kun si awọn sẹẹli ti o gbin, ki o si dapọ pọ, gbogbo awọn sẹẹli le ni idapo daradara pẹlu lysate, ati awọn sẹẹli ti wa ni lysed patapata.Lẹhin ti awọn sẹẹli ti wa ni lysed, awọn eroja ti nṣiṣe lọwọ ninu lysate ṣe idiwọ RNase intracellular lẹsẹkẹsẹ, nitorinaa RNA naa wa ni mimule.Iyẹn ni lati sọ, nitori pe awọn sẹẹli ti o gbin ni irọrun ati ni kikun kan si pẹlu lysate, RNA wọn ko ni irọrun degraded;ni ida keji, RNA ti o wa ninu àsopọ naa ni irọrun ti bajẹ nitori pe awọn sẹẹli ti o wa ninu àsopọ ko rọrun lati yara kan si lysate.nitori olubasọrọ to.Nitorina,a ro pe ọna kan wa lati yi ẹran ara pada si sẹẹli kan lakoko ti o ṣe idiwọ iṣẹ RNA, iṣoro ibajẹ le jẹ ipinnu patapata.

Liquid nitrogen milling jẹ ọna ti o munadoko julọ.Sibẹsibẹ, ọna milling nitrogen olomi jẹ wahala pupọ, paapaa nigbati nọmba awọn ayẹwo ba tobi.Eyi jẹ ki ohun ti o dara julọ jẹ atẹle: homogenizer.Awọnhomogenizerọna ko ṣe akiyesi ibeere ti bii iṣẹ RNase ṣe ni idinamọ ṣaaju ki awọn sẹẹli kan si pẹlu lysate, ṣugbọn kuku gbadura pe oṣuwọn idalọwọduro tissu yiyara ju oṣuwọn eyiti RNase intracellular degrades RN.

Ipa ti homogenizer itanna dara julọ,ati ipa ti homogenizer gilasi ko dara, ṣugbọn ni gbogbogbo, ọna homogenizer ko le ṣe idiwọ lasan ibajẹ naa.Nitorinaa, ti isediwon ba bajẹ, a gbọdọ lo homogenizer itanna atilẹba fun lilọ pẹlu nitrogen olomi;awọn atilẹba gilaasi homogenizer yẹ ki o wa ni yipada si ẹya ina homogenizer tabi taara milled pẹlu omi nitrogen.Iṣoro naa fẹrẹ to 100% ṣee ṣe.gba ipinnu.

Iṣoro aloku aimọ ti o kan awọn adanwo ti o tẹle ni awọn idi oniruuru diẹ sii ju ibajẹ, ati awọn ojutu jẹ iyatọ ni ibamu.Ni paripari,ti ibajẹ tabi awọn idoti ti o ku ninu àsopọ, ọna isediwon / reagent fun ohun elo idanwo kan pato gbọdọ wa ni iṣapeye.O ko ni lati lo awọn ayẹwo iyebiye rẹ fun iṣapeye: o le ra diẹ ninu awọn ẹranko kekere bi ẹja / adie lati ọja, mu apakan ti o baamu ti ohun elo fun isediwon RNA, ati apakan miiran fun isediwon amuaradagba - lọ pẹlu ẹnu, ikun ati ifun Jade.

RNA ibi-afẹde ti RNA ti o jade ni a lo fun oriṣiriṣi awọn adanwo atẹle, ati awọn ibeere didara rẹ yatọ

Itumọ ile ikawe cDNA nilo iduroṣinṣin RNA laisi awọn iṣẹku ti awọn inhibitors ifa enzymu;Ariwa nilo iduroṣinṣin RNA ti o ga julọ ati awọn ibeere kekere fun awọn iyokuro awọn inhibitors ti enzyme;RT-PCR ko nilo iduroṣinṣin RNA ga ju,ṣugbọn idilọwọ awọn aati enzymu.Awọn ibeere iyokù jẹ ti o muna.Awọn titẹ sii ipinnu awọn o wu;ni gbogbo igba ti ibi-afẹde ni lati gba RNA mimọ ti o ga julọ, yoo jẹ eniyan ati owo.

Gbigba / Ibi ipamọ ti Awọn ayẹwo

Awọn nkan ti o ni ipa lori ibajẹ Lẹhin ti ayẹwo naa ti lọ kuro ni ara alãye / tabi agbegbe idagbasoke atilẹba, awọn ensaemusi endogenous ninu apẹẹrẹ yoo bẹrẹ lati dinku RNA,ati oṣuwọn ibajẹ jẹ ibatan si akoonu ti awọn ensaemusi endogenous ati iwọn otutu.Ni aṣa, awọn ọna meji nikan ni o wa lati ṣe idiwọ iṣẹ ṣiṣe enzymu endogenous patapata: ṣafikun lysate lẹsẹkẹsẹ ati isokan daradara ati ni iyara;ge sinu awọn ege kekere ati lẹsẹkẹsẹ di ni omi nitrogen.Awọn ọna mejeeji nilo iṣẹ ṣiṣe ni iyara.Awọn igbehin ni o dara fun gbogbo awọn ayẹwo, nigba ti awọn tele jẹ nikan dara fun tissues pẹlu kekere akoonu ti awọn sẹẹli ati endogenous ensaemusi ati ki o rọrun lati homogenize.Ni pato, ẹran ara ọgbin, ẹdọ, thymus, pancreas, Ọlọ, ọpọlọ, ọra, isan iṣan, bbl jẹ didi ti o dara julọ pẹlu nitrogen olomi ṣaaju ki o to tẹsiwaju.

Fragmentation ati homogenization ti awọn ayẹwo

Awọn Okunfa ti o ni ipa Idibajẹ ati Pipin Ayẹwo Ikore jẹfun nipasẹ homogenization, eyiti o jẹ pipe ati itusilẹ pipe ti RNA.Awọn sẹẹli le jẹ isokan taara laisi fifọ.Tissues le ti wa ni homogenized nikan lẹhin dà.Iwukara ati awọn kokoro arun nilo lati fọ pẹlu awọn enzymu ti o baamu ṣaaju ki wọn le jẹ isokan.Tissues pẹlu kekere endogenous henensiamu akoonu ati ki o rọrun homogenization le ti wa ni itemole ati homogenized ni akoko kan ninu awọn lysate nipa a homogenizer;ohun ọgbin, ẹdọ, thymus, ti oronro, ọlọ, ọpọlọ, ọra, isan iṣan ati awọn ayẹwo miiran, boya ga ni awọn enzymu ti inu tabi ko ni irọrun isokan,nitorina idalọwọduro ara ati isokan gbọdọ ṣee ṣe lọtọ.Ọna ti o gbẹkẹle julọ ati ti iṣelọpọ julọ ti pipin jẹ milling pẹlu nitrogen olomi, ati pe ọna ti o gbẹkẹle julọ ti isokan ni lilo imudara homogenizer kan.Akọsilẹ pataki kan nipa milling pẹlu nitrogen olomi: ayẹwo ko gbọdọ jẹ thawed lakoko gbogbo ilana milling, nitori awọn enzymu endogenous jẹ diẹ sii lati ṣiṣẹ nigbati didi.

Yiyan ti lysate

Ni ipa ni irọrun ti iṣiṣẹ ati awọn ifosiwewe ti awọn idoti ti o ku endogenous Awọn ojutu lysis ti a lo nigbagbogbo le ṣe idiwọ iṣẹ ṣiṣe ti RNase.Nitorinaa, aaye pataki ti yiyan ojutu lysis ni lati gbero ni apapo pẹlu ọna isọdi.Iyatọ kan wa:awọn ayẹwo pẹlu akoonu henensiamu ti o ga julọ ni a gbaniyanju lati lo lysate ti o ni phenol lati mu agbara lati mu awọn enzymu alaiṣe ṣiṣẹ.

Yiyan ti ìwẹnumọ ọna

Awọn nkan ti o ni ipa lori awọn aimọ endogenous ti o ku, iyara isediwon Fun awọn ayẹwo mimọ gẹgẹbi awọn sẹẹli, awọn abajade itelorun le ṣee gba pẹlu fere eyikeyi ọna iwẹnumọ ni ọwọ.Ṣugbọn fun ọpọlọpọ awọn ayẹwo miiran, ni pataki awọn ti o ni awọn ipele giga ti awọn aimọ gẹgẹbi awọn ohun ọgbin, ẹdọ, kokoro arun, ati bẹbẹ lọ, yiyan ọna iwẹnumọ to dara jẹ pataki.Ọna isọdọmọ centrifugal ọwọn ni iyara isediwon iyara ati pe o le mu awọn aimọ kuro ni imunadoko ti o ni ipa iṣesi enzymatic ti o tẹle ti RNA, ṣugbọn o jẹ gbowolori (Foregene le pese awọn ohun elo ti o munadoko-owo, awọn alaye diẹ sii tẹNibi);lilo ti ọrọ-aje ati awọn ọna iwẹnumọ Ayebaye, gẹgẹbi ojoriro LiCl, tun le gba awọn abajade itelorun, ṣugbọn akoko iṣẹ naa gun..

"Awọn ibawi mẹta ati awọn akiyesi mẹjọ" fun Iyọkuro RNA

Ìbáwí 1:Fi opin si idoti ti awọn enzymu exogenous.

Akiyesi 1:Mu awọn iboju iparada ati awọn ibọwọ mu.

Akiyesi 2:Awọn tubes centrifuge, awọn ori Italologo, awọn ọpa pipette, awọn tanki electrophoresis, ati awọn ijoko idanwo ti o kopa ninu idanwo yẹ ki o sọnu daradara.

Akiyesi 3:Awọn atunṣe/awọn ojutu ti o ni ipa ninu idanwo naa, paapaa omi, gbọdọ jẹ ọfẹ RNase.

Ìbáwí 2:Dina iṣẹ ṣiṣe ti awọn enzymu endogenous

Akiyesi 4:Yan ọna homogenization ti o yẹ.

Akiyesi 5:Yan ohun yẹ lysate.

Akiyesi 6:Ṣakoso iye ibẹrẹ ti ayẹwo naa.

Ìbáwí 3:Ṣe alaye idi isediwon rẹ

Akiyesi 7:Pẹlu eyikeyi eto lysate ti o sunmọ iwọn ibẹrẹ ti o pọju ti ayẹwo, oṣuwọn aṣeyọri isediwon ṣubu ni kiakia.

Akiyesi 8:Ipin ọrọ-aje nikan fun isediwon RNA aṣeyọri jẹ aṣeyọri ninu awọn adanwo ti o tẹle, kii ṣe ikore.

Top 10 awọn orisun ti RNase kontaminesonu

1. Awọn ika ọwọ jẹ orisun akọkọ ti awọn enzymu exogenous, nitorinaa awọn ibọwọ gbọdọ wọ ati rọpo nigbagbogbo.Ni afikun, awọn iboju iparada gbọdọ tun wọ, nitori mimi tun jẹ orisun pataki ti awọn enzymu.Anfaani afikun ti wọ iboju ibọwọ kan ni lati daabobo oluṣewadii naa.

2. Awọn imọran pipette, awọn tubes centrifuge, pipettes - RNase ko le ṣe aṣiṣẹ nipasẹ sterilization nikan, nitorina awọn itọnisọna pipette ati awọn tubes centrifuge yẹ ki o ṣe itọju pẹlu DEPC, paapaa ti wọn ba samisi bi DEPC ṣe itọju.O dara julọ lati lo pipette pataki kan, mu ese rẹ pẹlu 75% oti owu ọti ṣaaju lilo, paapaa ọpa;ni afikun, rii daju pe o ko lo ori yiyọ kuro.

3. Omi / saarin gbọdọ jẹ ofe ti kontaminesonu RNase.

4. O kere ju tabili idanwo yẹ ki o parun pẹlu 75% awọn boolu owu oti.

5.Endogenous RNase Gbogbo awọn tissu ni awọn ensaemusi ailopin, nitorina didi iyara ti awọn tissues pẹlu nitrogen olomi ni ọna ti o dara julọ lati dinku ibajẹ.Ibi ipamọ omi nitrogen olomi / ọna lilọ jẹ nitootọ korọrun, ṣugbọn o jẹ ọna nikan fun awọn tissu pẹlu awọn ipele giga ti awọn ensaemusi endogenous.

6. Awọn ayẹwo RNA Awọn ọja isediwon RNA le ni awọn itọpa ti ibajẹ RNase ninu.

7. Plasmid isediwon Plasmid igba nlo Rnase lati degrade RNA, ati awọn ti o ku Rnase yẹ ki o wa digested pẹlu Proteinase K ati jade nipa PCI.

8. Ibi ipamọ RNA Paapa ti o ba wa ni ipamọ ni iwọn otutu kekere, iye ti RNase yoo fa ibajẹ RNA.Ojutu ti o dara julọ fun itọju igba pipẹ ti RNA jẹ iyọ / idadoro oti, nitori oti ṣe idiwọ gbogbo iṣẹ enzymatic ni awọn iwọn otutu kekere.

9. Nigbati awọn cations (Ca, Mg) ni awọn ions wọnyi, alapapo ni 80C fun awọn iṣẹju 5 yoo fa RNA lati wa ni cleaved, nitorina ti RNA ba nilo lati gbona, ojutu itọju nilo lati ni oluranlowo chelating (1mM Sodium Citrate, pH 6.4).

10. Awọn enzymu ti a lo ninu awọn idanwo ti o tẹle le jẹ ti doti nipasẹ RNase.

10 Italolobo fun RNA isediwon

1: Ni kiakia dena RNase aṣayan iṣẹ-ṣiṣe.Awọn ayẹwo ti wa ni aotoju ni kiakia lẹhin gbigba, ati RNase ti wa ni aṣiṣẹ nipasẹ iṣẹ iyara lakoko lysis.

2: Yan ọna isediwon ti o yẹ fun àsopọ pẹlu akoonu ribozyme giga, ati adipose tissue jẹ dara julọ lati lo ọna ti o ni phenol.

3: Didara asọtẹlẹ nilo Northern, cDNA ìkàwé ikole nilo ga iyege, ati RT-PCR ati RPA (Ribonuclease Idaabobo assay) ko beere ga iyege.RT-PCR nilo mimọ giga (awọn iyokù inhibitor enzyme).

4: Imudara homogenization ni kikun jẹ bọtini si ilọsiwaju ikore ati idinku ibajẹ.

5: Ṣayẹwo iṣotitọ ti iṣawari electrophoresis RNA, 28S: 18S = 2: 1 jẹ ami pipe, 1: 1 tun jẹ itẹwọgba fun ọpọlọpọ awọn adanwo.

6: Yiyọ DNA kuro fun RT-PCR, itupalẹ orun O dara julọ lati lo DNA I lati yọ DNA kuro.

7: Din idoti ti awọn enzymu exogenous - awọn enzymu ko le ṣe gbe wọle lati ita.

8: Nigbati o ba n ṣojukọ acid nucleic ifọkansi kekere, o yẹ ki o ṣafikun reagent àjọ-ojo.Ṣugbọn lati ṣe idiwọ alapọpọ ti o ni awọn enzymu ati idoti DNA.

9: Tu RNA daradara, ti o ba jẹ dandan, ooru ni 65C fun awọn iṣẹju 5.

o dara ipamọ ọna

O le wa ni ipamọ ni -20C fun igba diẹ, ati ni -80C fun igba pipẹ.Igbesẹ akọkọ ni imudarasi awọn ikore RNA ni lati mọ pe akoonu RNA ti awọn ayẹwo oriṣiriṣi yatọ pupọ.Opo pupọ (2-4ug/mg) gẹgẹbi ẹdọ, pancreas, okan, agbedemeji agbedemeji (0.05-2ug/mg) gẹgẹbi ọpọlọ, oyun, kidinrin, ẹdọfóró, thymus, ovary, low abundance (<0.05ug/mg) mg) gẹgẹbi àpòòtọ, egungun, ọra.

1: Awọn sẹẹli Lyse lati tu RN silẹ - ti RNA ko ba tu silẹ, ikore yoo dinku.Isọpọ ina mọnamọna ṣiṣẹ dara julọ ju awọn ọna isokan miiran lọ, ṣugbọn o tun le nilo lati ni idapo pẹlu awọn ọna miiran, gẹgẹbi omi nitrogen mashing, enzymatic digestion (Lysozyme/Lyticase)

2: Ti o dara ju ti isediwon ọna.Awọn iṣoro ti o tobi julọ pẹlu awọn ọna ti o da lori phenol jẹ isọdi ti ko pe ati ipadanu RNA apa kan (a ko le yọ supernatant kuro patapata).Itọpa ti ko pari jẹ nitori acid nucleic giga ati akoonu amuaradagba, eyiti o le yanju nipasẹ jijẹ iye lysate ti a lo tabi idinku iye ayẹwo.Igbesẹ kan ti isediwon chloroform ni a fi kun si ara adipose.Pipadanu RNA le dinku nipasẹ fifa-pada tabi nipa yiyọ Layer Organic ti o tẹle nipasẹ centrifugation.Iṣoro ti o tobi julọ pẹlu awọn ọna orisun centrifugation ọwọn jẹ apẹẹrẹ apọju.

Classic isediwon Tips

1. Phenol ìwẹnumọ: Fi ohun dogba iwọn didun ti 1: 1 Phenol / Chloroform ati ki o illa vigorously fun 1-2 iṣẹju.Centrifuge ni iyara giga fun awọn iṣẹju 2.Farabalẹ yọ supernatant (80-90%) kuro.Maṣe gba si Layer aarin.Iwọn dogba ti ojutu esi le ṣe afikun si phenol/Chloroform ati yọkuro supernatant kuro.Awọn supernatants meji ni a le dapọ papọ fun ojoriro acid nucleic lati mu ikore dara si.Maṣe jẹ pẹlẹ pupọ nigbati o ba dapọ, maṣe gbiyanju lati yọ gbogbo ohun ti o ga julọ kuro.

2. Fifọ pẹlu 70-80% ethanol: Lakoko fifọ, acid nucleic gbọdọ wa ni idaduro lati rii daju pe iyọ iyokù ti fọ kuro.Ni akoko kanna, lẹsẹkẹsẹ lẹhin sisọ ethanol, centrifuge ni iyara giga fun iṣẹju diẹ, lẹhinna yọ ethanol ti o ku pẹlu pipette kan.Tu lẹhin ti o duro ni iwọn otutu yara fun iṣẹju 5-10.

11. Isediwon ti pataki ajo

1. Fibrous tissue: Awọn bọtini si isediwon RNA lati fibrous àsopọmọBurọọdubandi bi okan/skeletal isan ni lati disrupt patapata awọn àsopọ.Awọn ara wọnyi ni iwuwo sẹẹli kekere, nitorinaa iye RNA fun iwuwo ẹyọkan ti àsopọ jẹ kekere, ati pe o dara julọ lati lo iye ibẹrẹ bi o ti ṣee.Rii daju lati lọ ẹran naa daradara labẹ awọn ipo didi.

2. Awọn iṣan ti o ni amuaradagba giga / akoonu ọra: ọpọlọ / akoonu ọra ẹfọ jẹ giga.Lẹhin ti PCI isediwon, awọn supernatant ni awọn funfun floccules.Agbofinro gbọdọ tun fa jade pẹlu chloroform.

3. Awọn iṣan ti o ni giga nucleic acid / ribozyme akoonu: Ọlọ / thymus ni o ni giga nucleic acid ati akoonu ribozyme.Lilọ àsopọ labẹ awọn ipo didi ti o tẹle pẹlu isọdọkan iyara le mu awọn ribozymes ṣiṣẹ ni imunadoko.Bibẹẹkọ, ti lysate ba jẹ viscous pupọ (nitori akoonu acid nucleic giga), isediwon PCI kii yoo ni anfani lati stratify daradara;fifi diẹ sii lysate le yanju ọrọ yii.Ọpọ PCI ayokuro le yọ diẹ aloku DNA.Ti itọsi funfun kan ba farahan lẹsẹkẹsẹ lẹhin fifi ọti kun, o tọka si ibajẹ DNA.Tun-isediwon pẹlu ekikan PCI lẹhin itu le yọ DNA kontaminesonu.

4. Ohun ọgbin: Asopọ ọgbin jẹ eka sii ju ẹran ara ẹran lọ.Ni gbogbogbo, awọn ohun ọgbin ti wa ni ilẹ labẹ awọn ipo nitrogen olomi, nitorinaa ibajẹ RNA nipasẹ awọn ensaemusi endogenous jẹ loorekoore.Ti iṣoro ibajẹ naa ko ba yanju, o fẹrẹ jẹ daju pe o ṣẹlẹ nipasẹ awọn aimọ ti o wa ninu apẹẹrẹ.Awọn impurities ti o wa ninu ọpọlọpọ awọn eweko yoo ja si awọn iṣẹku, ati awọn idi fun awọn iṣẹku ni igba nitori awọn wọnyi impurities ni diẹ ninu awọn afijq pẹlu RNA: o precipitate ati ki o Mo precipitate, ati awọn ti o adsorb ati ki o Mo adsorb.Awọn abuda wọnyi pinnu pe wọn jẹ awọn inhibitors henensiamu ti o lagbara pupọ.

Ni lọwọlọwọ, awọn isọdọtun isediwon RNA ti iṣowo le ṣe deede si gbogbo awọn ẹran ara ẹranko pẹlu awọn atunṣe kekere, ṣugbọn awọn isọdọtun isediwon RNA ti iṣowo diẹ wa ti o le dara fun pupọ julọ awọn ohun ọgbin.Da, Foregene le pese patakiohun elo isediwon RNA ọgbin, a niOhun ọgbin Total RNA Ipinya ohun elo, Ohun ọgbin Total RNA Ipinya ohun elo Plus.Igbẹhin jẹ apẹrẹ pataki fun awọn ohun ọgbin pẹlu polysaccharide giga ati akoonu polyphenol.Fun isediwon RNA, esi lati ọdọ awọn olumulo lab jẹ dara julọ.

12. Ipa ti didi ayẹwo ati thawing Ayẹwo tio tutunini le jẹ tobi, ati pe o nilo lati ge ṣaaju lilo fun isediwon RNA.Awọn apẹẹrẹ ṣọ lati yo (o ṣee ni apakan) lakoko gige.Awọn ayẹwo tutunini le nilo lati ṣe iwọn ṣaaju isediwon RNA, ati thawing yoo dajudaju waye lakoko ilana yii.Nigbakuran, thawing ti ayẹwo tun waye lakoko ilana milling nitrogen olomi;tabi awọn tutunini ayẹwo ti wa ni taara fi kun si awọn lysate lai omi nitrogen milling, ati thawing yoo pato waye ṣaaju ki awọn pipe homogenization.Awọn adanwo ti fihan pe àsopọ tio tutunini jẹ itara si ibajẹ RNA lakoko gbigbẹ ju ti ara tuntun lọ.Idi ti o ṣeese: Ilana didi-diẹ ṣe idalọwọduro awọn ẹya laarin sẹẹli, ti o jẹ ki o rọrun fun awọn enzymu inu lati wa si olubasọrọ taara pẹlu RNA.

13. Idajọ ti RNA didara Nigbagbogbo, electrophoresis ti wa ni lo lati ṣe idajọ awọn iyege ti RNA, ati A260/A280 ti wa ni lo lati ṣe idajọ awọn ti nw ti RNA.Ni imọran, RNA mule ni ipin kan ti 28S: 18S = 2.7: 1, ati pe pupọ julọ data tẹnumọ ipin ti 28S: 18S = 2: 1.Otitọ ni pe ko si ọkan ninu RNA ti o jade lati awọn ayẹwo miiran yatọ si awọn sẹẹli ti o wa ni ipin 2: 1 (eyi gba ni lilo Agilent Bioanalyzer).

Awọn abajade electrophoresis ti RNA ni ipa nipasẹ ọpọlọpọ awọn ifosiwewe, pẹlu eto atẹle, awọn ipo elekitirophoresis, fifuye ayẹwo, iwọn itẹlọrun nipasẹ EB, bbl Lo electrophoresis abinibi lati ṣawari RNA ati lo Aami DNA bi iṣakoso.Ti 28S ni 2kb ati 18S ni 0.9kb jẹ kedere, ati 28S: 18S> 1, iyege le pade awọn ibeere ti awọn adanwo ti o tẹle julọ.

A260/A280 jẹ itọkasi ti o ti fa ọpọlọpọ iporuru.Ni akọkọ, o jẹ dandan lati ṣe alaye itumọ atilẹba ti itọkasi yii fun awọn acids nucleic: RNA mimọ, A260/280 rẹ = nipa 2.0.RNA mimọ jẹ 'idi' ati A260/A280 = 2 ni 'ipa'.Bayi gbogbo eniyan nlo A260/A280 bi 'idi', lerongba pe "Ti A260/A280 = 2, lẹhinna RNA jẹ mimọ", eyiti o yori si iporuru nipa ti ara.

Ti o ba nifẹ, o le ṣafikun reagent kekere kan ti a lo nigbagbogbo ni isediwon, gẹgẹbi phenol, guanidine isothiocyanate, PEG, ati bẹbẹ lọ, si ayẹwo RNA rẹ, lẹhinna wọn iwọn A260/A280.Otitọ ni pe ọpọlọpọ awọn reagents ti a lo fun isediwon RNA, ati ọpọlọpọ awọn idoti ninu apẹẹrẹ, fa ni ayika A260 ati A280, ti o kan A260/A280.

Ọna itọnisọna julọ ni lọwọlọwọ ni lati ṣe ayẹwo awọn ayẹwo RNA ni iwọn 200-300 nm.Ipin ti RNA mimọ ni awọn abuda wọnyi: ohun ti tẹ jẹ dan, A230 ati A260 jẹ awọn aaye inflection meji, A300 sunmọ 0, A260/A280 = ni ayika 2.0, ati A260/A230 = ni ayika 2.0.Ti data ọlọjẹ ko ba wa, ipin A260/A230 gbọdọ tun pinnu, nitori ipin yii jẹ ifarabalẹ si gbigbe gbogbo awọn aimọ ti o ni ipa lori iṣesi enzymatic.Ṣe akiyesi iwọn ila ti ẹrọ naa (0.1-0.5 fun A260).

Awọn iṣẹlẹ miiran ti o wulo meji wa: ipin yoo jẹ nipa 0.3 kekere nigbati A260/A280 ti wọn ninu omi;lakoko ti ipin ti a wọn ni 10 mM EDTA jẹ nipa 0.2 ti o ga ju eyiti a ṣewọn ni 1 mM EDTA.

Awọn ọja ti o jọmọ:

China Plant Total RNA ipinya Apo olupese ati olupese |Foregene (foreivd.com)

RNA ipinya jara Suppliers ati Factory |Awọn oluṣelọpọ ipinya RNA RNA China (foreivd.com)

RNA ipinya jara – Foregene Co., Ltd. (foreivd.com)