O ti wa ni daradara mọ pe ni aarin dogma, RNA ni transcriptional mediator laarin DNA ati amuaradagba ikosile.Ti a ṣe afiwe pẹlu wiwa DNA, iṣawari ti RNA le ṣe afihan ifojusọna diẹ sii ni ifojusọna apilẹṣẹ ninu awọn ohun alumọni.Awọn idanwo ti o kan RNA pẹlu: qRT-PCR, RNA-Seq, ati wiwa jiini idapọ, ati bẹbẹ lọ Da lori awọn abuda ti RNA funrararẹ (oruka suga ti RNA ni ẹgbẹ hydroxyl ọfẹ kan ju iwọn suga DNA lọ), papọ pẹlu nọmba nla ti RNases ni agbegbe, RNA jẹ riru diẹ sii ati rọrun lati dinku ju DNA lọ.Idọti sinu, idoti jade, ti didara RNA ko ba dara, lẹhinna awọn abajade esiperimenta gbọdọ jẹ ailojulọrun, ni pataki ti o farahan bi data ti ko pe tabi aiṣe atunṣe ti ko dara.Nitorinaa, akiyesi diẹ sii yẹ ki o san si sisẹ ti RNA, ati ọna asopọ ti iṣakoso didara tun jẹ pataki diẹ sii lati rii daju pe konge ati deede ti data esiperimenta ti o tẹle.

Fun iṣakoso didara ti RNA, gbogbo awọn ọna ti o wọpọ lo wa:

• Spectrophotometry
• agarose jeli electrophoresis
• Agilent Bioanalyzer
• pipo Fuluorisenti gidi-akoko PCR
• Qubit Fuluorisenti dai ọna

01 Spectrophotometry

RNA ti so awọn iwe ifowopamosi meji pọ ati pe o ni tente gbigba gbigba ni iwọn gigun ti 260nm.Gẹgẹbi ofin Lambert-Beer, a le ṣe iṣiro ifọkansi RNA lati oke gbigba ni 260nm.Ni afikun, a tun le ṣe iṣiro mimọ ti RNA ni ibamu si ipin ti 260nm, 280nm ati 230nm gbigba awọn oke giga.280nm ati 230nm jẹ awọn oke gbigba ti awọn ọlọjẹ ati awọn ohun elo kekere, lẹsẹsẹ.Ipin A260/A280 ati A260/A230 ti RNA ti o peye yẹ ki o tobi ju 2. Ti o ba kere ju 2, o tumọ si pe amuaradagba tabi ibajẹ moleku kekere wa ninu ayẹwo RNA ati pe o nilo lati sọ di mimọ lẹẹkansi.Awọn orisun ibajẹ yoo ni ipa lori awọn adanwo ni isalẹ, gẹgẹbi idinamọ ṣiṣe imudara ti awọn aati PCR, ti o mu abajade awọn abajade pipo ti ko pe.Mimo ti RNA ni ipa nla lori awọn abajade atẹle, nitorinaa spectrophotometry jẹ ọna asopọ iṣakoso didara ko ṣe pataki ni igbesẹ akọkọ ni awọn adanwo acid nucleic.

olusin 1. Aṣoju RNA/DNA Absorption Spectrum

02 Agarose jeli electrophoresis

Ni afikun si mimọ, iduroṣinṣin ti RNA tun jẹ ọkan ninu awọn itọkasi pataki fun ṣiṣe idajọ didara RNA.Ibajẹ ti RNA yoo ja si nọmba nla ti awọn ajẹkù kukuru ninu apẹẹrẹ, nitorinaa nọmba awọn ajẹkù RNA ti o le rii ni imunadoko ati bo nipasẹ ọna itọkasi yoo dinku.Iduroṣinṣin RNA le ṣe ayẹwo nipasẹ electrophoresis ti RNA lapapọ lori jeli agarose 1%.Ọna yii le tunto jeli funrararẹ, tabi lo Eto E-Gel™ ti a ti ṣe tẹlẹ fun idanwo iduroṣinṣin.Diẹ ẹ sii ju 80% ti lapapọ RNA jẹ ribosomal RNA, pupọ julọ eyiti o jẹ 28S ati 18S rRNA (ninu awọn eto mammalian).Didara didara RNA yoo ṣafihan awọn ifipa didan ti o han gbangba meji, eyiti o jẹ 28S ati awọn ifi didan 18S, ni atele, ni 5 Kb ati 2 Kb, ati ipin yoo ṣọ lati sunmọ 2: 1.Ti o ba wa ni ipo kaakiri, o tumọ si pe ayẹwo RNA le ti bajẹ, ati pe o gba ọ niyanju lati lo ọna ti a ṣalaye nigbamii lati ṣe idanwo didara RNA siwaju sii.

Ṣe nọmba 2. Ifiwera ti degraded (ọna 2) ati RNA ti o wa titi (ọna 3) lori agarose gel electrophoresis

03 Agilent Bioanalyzer

Ni afikun si ọna elerophoresis gel agarose ti a ṣalaye loke, eyiti o le ṣe iranlọwọ fun wa lati ṣe idanimọ iduroṣinṣin ti RNA ni irọrun ati yarayara, a tun le lo Agilent bioanalyzer lati pinnu iduroṣinṣin ti RNA.O nlo apapo ti microfluidics, capillary electrophoresis, ati fluorescence lati ṣe ayẹwo ifọkansi RNA ati iduroṣinṣin.Nipa lilo algorithm ti a ṣe sinu lati ṣe itupalẹ profaili ti apẹẹrẹ RNA, Agilent bioanalyzer le ṣe iṣiro itọkasi iye iyege RNA kan, Nọmba Integrity Number RNA (lẹhinna tọka si bi RIN) [1].Ti iye RIN ti o tobi si, iyege RNA ga julọ (1 ti bajẹ pupọ, 10 jẹ pipe julọ).Diẹ ninu awọn idanwo ti o kan RNA daba lilo RIN bi paramita fun igbelewọn didara.Gbigba awọn idanwo itọsẹ-giga (lẹhin ti a tọka si bi NGS) gẹgẹbi apẹẹrẹ, awọn itọsọna ti Oncomine ™ Human Immune Repertoire, eyiti o lo lati ṣe awari sẹẹli B ati awọn olugba antigen T cell ninu jara Thermo Fisher's Oncomine panel, daba pe awọn ayẹwo pẹlu awọn iye RIN ti o tobi ju 4, Awọn kika ti o munadoko diẹ sii ati awọn ere ibeji le ṣe iwọn 3).Awọn sakani iṣeduro oriṣiriṣi wa fun awọn panẹli oriṣiriṣi, ati nigbagbogbo RIN ti o ga julọ le mu data ti o munadoko diẹ sii.

Nọmba 3, ninu Oncomine™ Awọn adanwo Repertoire Ajẹsara Eniyan, awọn ayẹwo pẹlu RIN ti o tobi ju 4 le ṣe awari awọn kika ti o munadoko diẹ sii ati awọn ere ibeji sẹẹli T.【2】

Sibẹsibẹ, iye RIN tun ni awọn idiwọn diẹ.Botilẹjẹpe RIN ni ibamu giga pẹlu didara data esiperimenta NGS, ko dara fun awọn ayẹwo FFPE.Awọn ayẹwo FFPE ti ni itọju kemikali fun igba pipẹ, ati pe RNA ti o jade ni gbogbogbo ni iye RIN kekere ti o jo.Sibẹsibẹ, eyi ko tumọ si pe data ti o munadoko ti idanwo naa gbọdọ jẹ alaiwulo.Lati ṣe ayẹwo deede didara awọn ayẹwo FFPE, a nilo lati lo awọn wiwọn miiran yatọ si RIN.Ni afikun si RIN, Agilent bioanalyzer tun le ṣe iṣiro iye DV200 bi paramita igbelewọn ti didara RNA.DV200 jẹ paramita kan ti o ṣe iṣiro ipin ti awọn ajẹkù ti o tobi ju 200 bp ninu apẹẹrẹ RNA kan.DV200 jẹ afihan ti o dara julọ ti didara ayẹwo FFPE ju RIN lọ.Fun RNA ti o jade nipasẹ FFPE, o ni ibamu ti o ga pupọ pẹlu nọmba awọn jiini ti o le rii daradara ati oniruuru awọn Jiini [3].Botilẹjẹpe DV200 le ṣe atunṣe fun awọn ailagbara ninu wiwa didara ti FFPE, Agilent bioanalyzer tun ko le ṣe itupalẹ awọn iṣoro didara ni awọn ayẹwo RNA, pẹlu boya awọn inhibitors wa ninu awọn ayẹwo.Awọn inhibitors funrararẹ le ni ipa imudara imudara ti awọn adanwo isalẹ ati dinku iye data ti o wulo.Lati mọ boya inhibitor kan wa ninu apẹẹrẹ, a le gba ọna PCR pipo fluorescent ti o ṣapejuwe atẹle.

04 pipo Fuluorisenti gidi-akoko PCR

Ọna pipo Fuluorisenti gidi-akoko PCR ko le ṣe awari awọn inhibitors ninu ayẹwo nikan, ṣugbọn tun ṣe afihan didara RNA ni deede ni apẹẹrẹ FFPE.Ti a ṣe afiwe pẹlu awọn atunnkanka igbe aye Agilent, awọn ohun elo pipo fluorescence ni akoko gidi jẹ olokiki diẹ sii ni awọn ile-iṣere ti ibi pataki nitori ohun elo wọn gbooro.Lati ṣe idanwo didara awọn ayẹwo RNA, a nilo lati ra tabi mura awọn iwadii alakoko fun awọn jiini itọkasi inu, gẹgẹbi GUSB (Cat no. Hs00939627).Nipa lilo ṣeto ti awọn alakoko, awọn iwadii ati awọn iṣedede (apapọ RNA ti ifọkansi ti a mọ) lati ṣe awọn adanwo pipo pipe, ifọkansi ajẹkù RNA ti o munadoko le ṣe iṣiro bi idiwọn igbelewọn ti didara RNA (Quantitation RNA iṣẹ-ṣiṣe (FRQ) fun kukuru).Ninu idanwo NGS kan, a rii pe FRQ ti awọn ayẹwo RNA ni ibamu ti o ga pupọ pẹlu iwọn data to munadoko.Fun gbogbo awọn ayẹwo ti o tobi ju 0.2ng/ul FRQ, o kere ju 70% ti awọn kika le ni imunadoko bo itọka itọka naa (Nọmba 4).

Ṣe nọmba 4, iye FRQ ti a rii nipasẹ ọna iwọn fluorescence ni ibamu ti o ga pupọ (R2> 0.9) pẹlu data ti o munadoko ti a gba ni idanwo NGS.Laini pupa jẹ iye FRQ dogba si 0.2 ng/ul (log10 = -0.7).【4】

Ni afikun si lilo si awọn ayẹwo FFPE, ọna PCR akoko gidi le tun ṣe abojuto awọn inhibitors ni awọn ayẹwo.A le ṣafikun apẹẹrẹ lati wa-ri sinu eto ifaseyin pẹlu Iṣakoso Rere ti inu (IPC) ati Ayẹwo rẹ, ati lẹhinna ṣe iṣiro fluorescence lati gba iye Ct.Ti iye Ct ba wa ni ẹhin iye Ct ni ifaseyin-ayẹwo, o tọka si pe inhibitor wa ninu apẹẹrẹ ati ṣe idiwọ imudara imudara ninu iṣesi.

05 Qubit Fuluorisenti dai ọna

Qubit Fluorometer jẹ ohun elo kekere ti o wọpọ julọ ti a lo fun ifọkansi acid nucleic ati wiwa mimọ, eyiti o rọrun lati ṣiṣẹ ati pe o wa ni fere gbogbo ile-iṣẹ isedale isedale molikula.O ṣe iṣiro deede ni ifọkansi ti acid nucleic nipasẹ wiwa ati awọ fluorescent acid nucleic acid (reagent iwari Qubit).Qubit ni ifamọ giga ati pato, ati pe o le ṣe iwọn RNA ni deede si ifọkansi pg/µL.Ni afikun si agbara ti a mọ daradara lati ṣe iwọn deede ifọkansi acid nucleic, Awoṣe tuntun tuntun Thermo Fisher, Qubit 4.0, tun le rii iduroṣinṣin ti RNA.Eto wiwa RNA Qubit 4.0 (RNA IQ Assay) ṣe awari iduroṣinṣin ti RNA nipa wiwa awọn awọ Fuluorisenti meji kan pato.Awọn awọ Fuluorisenti meji wọnyi le sopọ si awọn ajẹkù nla ati awọn ajẹkù kekere ti RNA, lẹsẹsẹ.Awọn awọ Fuluorisenti meji wọnyi tọkasi ipin ti awọn ajẹkù nla ti RNA ninu apẹẹrẹ, ati lati eyi iye IQ (Iduroṣinṣin ati Didara) ti o nsoju didara RNA le ṣe iṣiro.Iwọn IQ jẹ iwulo si mejeeji FFPE ati awọn ayẹwo ti kii ṣe FFPE, ati pe o ni ipa nla lori didara atẹle atẹle.Gbigba awọn idanwo NGS gẹgẹbi apẹẹrẹ, ninu awọn idanwo idanwo RNA-Seq ti a ṣe lori pẹpẹ Ion torrent ™, ọpọlọpọ awọn ayẹwo pẹlu awọn iye IQ ti o tobi ju 4 ni o kere ju 50% kika ti o munadoko (Aworan 5).Ti a ṣe afiwe pẹlu awọn ọna wiwa ti a mẹnuba loke, Qubit IQ Assay kii ṣe irọrun diẹ sii lati ṣiṣẹ ati gba akoko diẹ (laarin iṣẹju marun), ṣugbọn tun ni ibamu nla laarin iye IQ paramita wiwọn ati didara data ti awọn adanwo isalẹ.

Nọmba 5, ibaṣepọ nla wa laarin iye Qubit RNA IQ ati awọn kika ti o ya aworan ti RNA-Seq.【5】

Nipasẹ ifihan ti o wa loke, Mo gbagbọ pe gbogbo eniyan ni oye ti o to ti awọn ọna iṣakoso didara RNA oriṣiriṣi.Ni iṣe, o le yanọna ti o baamu gẹgẹbi iru apẹẹrẹ ati awọn ohun elo ti o wa tẹlẹ.Nikan nipa ṣiṣakoso didara RNA daradara ni a le yago fun ikuna ti awọn adanwo ti o tẹle ti o fa nipasẹ didara apẹẹrẹ ti ko dara, nitorinaa fifipamọ akoko iyebiye, agbara ati idiyele.

Awọn ọja itọkasi:

Animal Total RNA ipinya Apo

Cell Total RNA ipinya Apo

awọn itọkasi

【1】 Schroeder, A., Mueller, O., Stocker, S. et al.RIN naa: nọmba iyege RNA kan fun fifi awọn iye iyege si awọn wiwọn RNA.BMC Molecular Biol 7, 3 (2006).https:// doi .org/10.1186/1471-21 99-7-3

【2】 Oncomine Human Immune Repertoire User Guide (Pub. No. MAN0017438 Rev. C.0).

【3】Leah C Wehmas, Charles E Wood, Brian N Chorley, Carole L Yauk, Gail M Nelson, Susan D Hester, Awọn Metiriki Didara ti Imudara fun Ṣiṣayẹwo RNA ti o wa lati Archival Formalin-Fixed Paraffin-Fixed Tissue Awọn ayẹwo, Awọn Imọ-iṣe Majele, Oṣu Kẹjọ 3025 73,https://doi.org/10.1093/toxsci/