Idanwo RT-qPCR pẹlu isediwon RNA ati igbelewọn didara, iyipada iyipada ati awọn igbesẹ qPCR mẹta, igbesẹ kọọkan ni ọpọlọpọ awọn iṣọra, a yoo ṣafihan ni alaye ni isalẹ.

Ⅰ.RNA didara igbelewọn

Ninu idanwo RT-qPCR, lẹhin ipari isediwon RNA, didara RNA nilo lati ṣe iṣiro, ati pe idanwo atẹle le ṣee ṣe lẹhin ti o jẹ oṣiṣẹ.Awọn ọna igbelewọn pẹlu spectrophotometer, Agilent gel electrophoresis, Agilent 2100 onínọmbà, laarin eyiti spectrophotometer ti o wọpọ julọ ti a lo ati wiwa ọna ọna elekitiropiresi gelrose.O yẹ ki o ṣe akiyesi pe awọn ọna meji wọnyi nilo lati lo papọ lati pari wiwa ati itupalẹ ti ifọkansi RNA, mimọ ati iduroṣinṣin, lati rii daju didara RNA.

Ohun elo Ipinya RNA ti o jọmọ: 

Cell Total RNA ipinya Apo

RNA ti a sọ di mimọ pupọ ati didara ga ni a le gba lati oriṣiriṣi awọn sẹẹli ti o gbin ni iṣẹju 11.

Animal Total RNA ipinya Apo

Ni kiakia ati daradara jade ni mimọ-giga ati didara lapapọ RNA lati ọpọlọpọ awọn ẹran ara ẹranko.

Spectrophotometer:

Awọn spectrophotometer ni akọkọ lo lati pinnu ifọkansi ati mimọ ti RNA, ṣugbọn ko le rii iduroṣinṣin ti RNA ati iyoku jiini.Lara wọn, A260/280 ati A260/230 jẹ awọn aye pataki fun wiwa mimọ RNA, ati mimọ RNA le ṣee rii ni ibamu si iyipada ti awọn iye wọn:

1. 1.9 2.1, nfihan ibajẹ apakan ti o ṣeeṣe ti RNA, eyiti o le jẹrisi siwaju sii nipasẹ agarose gel electrophoresis.

2. 2.0

Electrophoresis gel Agarose:

Agarose gel electrophoresis assay le ṣe itupalẹ iduroṣinṣin RNA, jiini ati awọn iṣẹku amuaradagba, ṣugbọn ko le ṣe deede iwọn ifọkansi ti RNA tabi ṣe awari awọn iṣẹku ti awọn reagents Organic.Mu awọn awoṣe RNA eukaryotic fun apẹẹrẹ:

1. Awọn RNA ti a tunmọ si agarose jeli electrophoresis.Ti o ba jẹ pe awọn ẹgbẹ ẹyọkan mẹta ti 28sRNA, 18sRNA ati 5.8sRNA lori maapu jeli, o tọka si pe RNA ti o jade wa ni mimule.Ti isẹlẹ fifa ba wa, o tọkasi ibajẹ apakan ti RNA.

2. Ti o ba ti wa ni kan nikan imọlẹ iye laarin awọn lẹ pọ iho ati awọn 28sRNA iye, nibẹ ni o le wa jinomiki DNA aloku.

3. Ti awọn ẹgbẹ ba han ninu iho lẹ pọ, o tọka si pe o le jẹ awọn iṣẹku ti amuaradagba ati awọn nkan macromolecular miiran.

Ⅱ. Yiyipada transcription

Lẹhin isediwon RNA ti pari, o nilo lati yi pada si cDNA fun awọn adanwo ti o tẹle, nitorinaa igbesẹ ipadasẹhin jẹ pataki.Iyipada iyipada ni yoo ṣe afihan lati yiyan ti transscriptase yiyipada ati alakoko:

Yiyan transscriptase yiyipada:

Awọn transcriptases iyipada aṣoju pẹlu AMV RTase ati MMLV RTase.RNase H ti AMV RTase ni iṣẹ ṣiṣe ti o lagbara, gigun kukuru kukuru, iye iṣelọpọ kekere ati iduroṣinṣin igbona to dara (42 ~ 55 ℃).Iṣẹ RNase H ti MMLV RTase jẹ alailagbara, gigun ti iṣelọpọ jẹ pipẹ, iye iṣelọpọ jẹ giga, ati iduroṣinṣin igbona ko dara (37 ~ 42℃).

Nitori pe enzymu RNase H ni iṣẹ ti awoṣe RNA abuku, MMLV pẹlu iṣẹ ṣiṣe RNase H ti ko lagbara yẹ ki o yan ni yiyan lakoko transcription, ati lẹhin imọ-ẹrọ jiini nigbamii, iduroṣinṣin igbona ti MMLV ti de fifo didara kan.Gbigba ForegeneTranscriptase Yiyipada Foreasy (M-MLV fun iyipada iyipada) bi apẹẹrẹ, o jẹ titun yiyipada transcriptase kosile ni E. coli engineered kokoro arun nipa lilo jiini recombination ọna ẹrọ.Ó jẹ́ polymerase DNA àtúnṣepọ̀ tí ó ṣe àkópọ̀ okun DNA àfikún láti RNA, DNA, tàbí RNA kan: DNA arabara.Ko ni iṣẹ RNase H, iduroṣinṣin to lagbara, isunmọ RNA to lagbara, ati ifamọ giga.

 

Transcriptase Yiyipada Foreasy (M-MLV fun iyipada iyipada)

Asayan alakoko:

Ni gbogbogbo RT awọn alakoko ṣubu si awọn ẹka mẹta: oligo dT, awọn alakoko laileto, ati awọn alakoko-pipa pato.Yan awọn alakoko ti o dara fun lilo ni ibamu si awọn ibeere idanwo oriṣiriṣi.

1. Ti awoṣe ba jẹ orisun eukaryotic ati pe a lo cDNA ti o pẹ fun imudara PCR deede, Oligo (dT) ni a ṣe iṣeduro;Ti o ba jẹ pe idanwo ti o tẹle nikan ni a lo fun qPCR, Oligo (dT) ni a gbaniyanju lati dapọ pẹlu awọn alakoko laileto lati mu ilọsiwaju ṣiṣe ti transcription pada.

2. Ti awoṣe ba wa lati awọn prokaryotes, Awọn alakoko ID tabi awọn alakoko jiini yẹ ki o yan fun iyipada iyipada.

Ⅲ.qPCR

Isọdiwọn Fluorescence jẹ alaye nipataki lati yiyan awọn ọna pipo, awọn ipilẹ apẹrẹ alakoko, yiyan ROX, iṣeto eto ifaseyin ati eto awọn ipo iṣe, ati bẹbẹ lọ.

Asayan awọn ọna pipo:

Awọn ọna pipo pin si awọn ọna pipo ojulumo ati awọn ọna pipo pipe.Ijẹrisi ibatan le ṣee lo lati ṣe awari ipa ti awọn ọna itọju kan lori ikosile jiini, ṣe awari iyatọ ti ikosile pupọ ni awọn akoko oriṣiriṣi ati ṣe afiwe iyatọ ti ikosile pupọ ni awọn oriṣiriṣi oriṣiriṣi.Idiwọn pipe le ṣe awari iye acid nucleic ninu ọlọjẹ ati bẹbẹ lọ.Nigbati o ba n ṣe awọn idanwo, a gbọdọ yan awọn ọna pipo ti o yẹ gẹgẹbi awọn adanwo tiwa.

Awọn ilana apẹrẹ akọkọ:

Apẹrẹ ti alakoko fun qPCR jẹ ibatan taara si imudara imudara ati iyasọtọ ọja.Nitorinaa, ṣiṣe apẹrẹ awọn alakoko ti o tọ ni igbesẹ akọkọ ti qPCR aṣeyọri.Ninu apẹrẹ ti alakoko, awọn ipilẹ atẹle yẹ ki o san ifojusi si nigbati o ba pade ipilẹ ti apẹrẹ alakoko ti aṣa:

1. Awọn ipari ti ajẹkù afojusun ti wa ni iṣakoso laarin 100 ati 300 bp;

2. Apẹrẹ agbelebu-exon lati yago fun ipa ti DNA genomic;

3. Awọn alakoko ti a ṣe apẹrẹ nilo lati ni idanwo fun imudara imudara, ati pe nikan nigbati imudara imudara ba de boṣewa (90-110%) le ṣee lo fun awọn adanwo iwọn;

4. Ifojusi alakoko jẹ iṣapeye nigbagbogbo laarin 0.1uM ati 1.0uM.

Asayan tiROX:

Ninu ilana iṣesi pipo, ROX le ṣatunṣe iyatọ ọna opopona, aṣiṣe pipetting tabi iyatọ iwọn didun ti o ṣẹlẹ nipasẹ evaporation ati condensation ni iṣọkan, imudarasi atunṣe ti awọn abajade.Sibẹsibẹ, o yẹ ki o ṣe akiyesi pe yiyan ti ROX ni ibatan si ohun elo naa.Ti ohun elo qPCR ba ni iṣẹ ti atunṣe iyatọ laarin awọn iho, ko nilo lati ṣafikun ROX;bibẹẹkọ, o nilo lati ṣafikun atunṣe ROX.Awọn alabaṣiṣẹpọ kekere ni rira awọn reagents gbọdọ wa ni ibamu si ohun elo ti a lo lati yan ROX to pe, yago fun awọn aṣiṣe nigbamii.

Igbaradi eto ifaseyin:

Awọn ipele idahun ti 20ul ati 50ul ni o fẹ.Awọn ọrọ wọnyi yẹ ki o san ifojusi si nigbati a ṣe agbekalẹ eto naa:

1. Eto ifaseyin nilo lati pese sile nipasẹ fentilesonu ni ibi-iṣẹ iṣẹ mimọ-ultra-clean, ddH tuntun₂O ti wa ni lilo fun kọọkan ṣàdánwò;

2. Kọọkan ṣàdánwò nilo lati mura NTC lati mọ daju boya o wa ni idoti ninu awọn eto, ati gbogbo bata ti alakoko nilo lati se NTC nigbati ngbaradi awọn eto;

3. Lati rii boya aloku gDNA wa ninu awoṣe RNA, NRT le ṣe imurasilẹ fun apẹẹrẹ kọọkan fun wiwa;

4. Nigbati o ba ngbaradi eto naa, o niyanju lati ṣe o kere 3 awọn atunṣe imọ-ẹrọ fun apẹẹrẹ kan;

5. Nigbati awoṣe jẹ cDNA, o niyanju lati dilute 5-10 igba lati din idinamọ ipa ti yiyipada transcription eto lori qPCR ṣàdánwò.O dara lati ṣawari iwọn awoṣe nipasẹ gradient, ki iye CT ṣubu laarin 20-30;

6. Ṣe ipinnu nọmba ti a beere fun awọn aati, pọ si nipasẹ 5-10% lori ipilẹ nọmba awọn aati, ati iṣiro nọmba iṣeto ni iwọn didun;

7, eto naa ti pese sile nipa lilo ipilẹ akọkọ, dapọ lẹhin centrifugation ati rii daju pe ko si awọn nyoju;

8, Bi o ti ṣee ṣe lati yan awọn ohun elo atilẹyin.

Jẹmọ RT-qPCR Apo