• facebook
  • ti sopọ mọ
  • youtube
asia_oju-iwe

Big discounting China High ifamọ Ọkan-Igbese wadi Rt-Qpcr Kit V2

Apejuwe Apo:

◮ Rọrun ati imunadoko: pẹlu Cell Direct RT ọna ẹrọ, RNA awọn ayẹwo le wa ni gba ni o kan 7 iṣẹju.

Ibeere ayẹwo jẹ kekere, bi kekere bi awọn sẹẹli 10 le ṣe idanwo.

◮Iwọn igbasilẹ giga: o le ṣe awari RNA ni kiakia ninu awọn sẹẹli ti a gbin ni 384, 96, 24, 12, 6-daradara farahan.

Eraser DNA le yarayara yọ awọn genomes ti a tu silẹ, dinku ipa pupọ lori awọn abajade esiperimenta ti o tẹle.

Iṣapeye RT ati eto qPCR jẹ ki ifasilẹ ipadasẹhin meji-igbesẹ RT-PCR daradara siwaju sii ati PCR ni pato diẹ sii, ati diẹ sii sooro si awọn inhibitors ifaseyin RT-qPCR.

foregene agbara


Alaye ọja

ọja Tags

FAQ

A ti ni iriri olupese.Gbigba pupọ julọ ninu awọn iwe-ẹri pataki ti ọja rẹ fun ẹdinwo nla China Ifamọ Igbesẹ Ọkan-Igbese Iwadi Rt-QpcrKit V2, Didara jẹ igbesi aye ile-iṣẹ, Idojukọ lori ibeere alabara jẹ orisun ti iwalaaye ile-iṣẹ ati idagbasoke, A ni ibamu si otitọ ati igbagbọ iṣẹ ṣiṣe ti o dara, n nireti wiwa rẹ!
A ti ni iriri olupese.Gbigba pupọ julọ ninu awọn iwe-ẹri pataki ti ọja rẹ funChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Ile-iṣẹ ile-iṣẹ wa: awọn idiyele ti o tọ, akoko iṣelọpọ kukuru ati iṣẹ itẹlọrun lẹhin-tita, a tun gba ọ lati ṣabẹwo si ile-iṣẹ wa ni eyikeyi akoko ti o fẹ.Fẹ bayi a ni kan dídùn ati ki o gun igba owo jọ!!!

Awọn apejuwe

Ohun elo yii nlo eto ifipamọ lysis alailẹgbẹ ti o le ṣe idasilẹ RNA ni kiakia lati awọn ayẹwo sẹẹli ti o gbin fun awọn aati RT-qPCR, nitorinaa imukuro akoko-n gba ati ilana isọdọmọ RNA alaapọn.Awoṣe RNA le gba ni iṣẹju 7 nikan.5 × Direct RT Mix ati 2× Taara qPCR Mix-SYBR reagents ti a pese nipasẹ ohun elo le yarayara ati imunadoko gba awọn abajade PCR pipo akoko gidi.

5 × Direct RT Mix ati 2 × Direct qPCR Mix-SYBR ni ifarada inhibitor ti o lagbara, ati lysate ti awọn ayẹwo le ṣee lo bi awoṣe fun RT-qPCR taara.Ohun elo yii ni alailẹgbẹ RNA giga-ibarapọ Foregene yiyipada transcriptase, ati Hot D-Taq DNA polymerase, dNTPs, MgCl2, saarin lenu, PCR optimizer ati amuduro.

Awọn pato

200×20μl Rxns, 1000×20μl Rxns

Awọn paati ohun elo

Apa I

Ifipamọ CL

Foregene Protease Plus II

Buffer ST

Apa II

DNA eraser

5× Taara RT Mix

2× Taara qPCR Mix-SYBR

50× ROX Itọkasi Dye

RNase-Ọfẹ ddH2O

Awọn ilana

Awọn ẹya & awọn anfani

■ Rọrun ati imunadoko: pẹlu imọ-ẹrọ Cell Direct RT, awọn ayẹwo RNA le gba ni iṣẹju 7 nikan.

■ Ibeere ayẹwo jẹ kekere, bi kekere bi awọn sẹẹli 10 le ṣe idanwo.

■ Imujade giga: o le ṣe awari RNA ni kiakia ninu awọn sẹẹli ti a gbin ni 384, 96, 24, 12, 6-well plates.

■ Eraser DNA le yara yọ awọn genomes ti a ti tu silẹ, dinku pupọ ni ipa lori awọn abajade idanwo ti o tẹle.

■ Iṣapeye RT ati eto qPCR jẹ ki ifasilẹ ipadasẹhin-igbesẹ meji RT-PCR ṣiṣẹ daradara ati PCR ni pato diẹ sii, ati diẹ sii sooro si awọn inhibitors ifasẹyin RT-qPCR.

Ohun elo Kit

Dopin ti ohun elo: gbin ẹyin.

- RNA ti a tu silẹ nipasẹ lysis ayẹwo: nikan wulo si awoṣe RT-qPCR ti ohun elo yii.

- Ohun elo naa le ṣee lo fun awọn idi wọnyi: itupalẹ ikosile jiini, ijẹrisi ti ipa ipalọlọ jiini-ilaja siRNA, ibojuwo oogun, ati bẹbẹ lọ.

Aworan atọka

Cell Direct RT qPCR aworan atọka

Ibi ipamọ ati igbesi aye Selifu

Apakan I ti kit yii yẹ ki o wa ni ipamọ ni 4 ℃;Apa II yẹ ki o wa ni ipamọ ni -20 ℃.

Foregene Protease Plus II yẹ ki o wa ni ipamọ ni 4℃, ma ṣe di ni -20℃.

Reagent 2× Taara qPCR Mix-SYBR yẹ ki o wa ni ipamọ ni -20℃ ninu okunkun;ti o ba ti lo nigbagbogbo, o tun le wa ni ipamọ ni 4 ℃ fun igba diẹ ipamọ (lo soke laarin 10 ọjọ) .A ti ni iriri olupese.Wining the poju in the crucial certifications of its market for Big discounting China High Sensitivity Ọkan-Igbese Probe Rt-Qpcr Kit V2, Didara jẹ factory' aye , Idojukọ lori onibara' eletan ni awọn orisun ti ile-iwalaaye ati idagbasoke, A adhere to otito ati ti o dara igbagbo ṣiṣẹ iwa, nwa siwaju si rẹ bọ !
Idinku nlaChina Taq DNA Polymerase, Qpcr, Awọn ile-iṣẹ ile-iṣẹ wa: awọn idiyele ti o tọ, akoko iṣelọpọ kukuru ati iṣẹ itẹlọrun lẹhin-tita, a tun gba ọ lati ṣabẹwo si ile-iṣẹ wa ni eyikeyi akoko ti o fẹ.Fẹ bayi a ni kan dídùn ati ki o gun igba owo jọ!!!


  • Ti tẹlẹ:
  • Itele:

  • QuickEasyTM Cell Direct RT-qPCR Kit -Taqman

    Cat.No.DRT-01021/01022

    Fun taara sẹẹli RT-qPCR ni lilo awọn sẹẹli ≤ 1000,000

    ifihan ọja

    Ọja yii nlo eto ifasilẹ lysis alailẹgbẹ lati tusilẹ RNA ni kiakia lati awọn ayẹwo sẹẹli ti o gbin fun awọn aati RT-qPCR, imukuro ilana isọdọmọ akoko ati iṣẹ ṣiṣe RNA, ati pe awọn iṣẹju 7 nikan lati gba awoṣe RNA ti o nilo, pẹlu 5 × Direct RT Mix, 2 × Direct qPCR Mix-Taqman ti a pese nipasẹ ohun elo naa le gba akoko gidi-akoko PCR ni iyara ati ni imunadoko.

    5 × Direct RT Mix ati 2 × Direct qPCR Mix-Taqman ni ifarada inhibitor ti o lagbara ati pe o le ṣe atunṣe daradara ati imudara pato nipa lilo lysate ti ayẹwo lati ṣe iwọn bi awoṣe.Reageni ni Foregene Reverse Transcriptase, Gbona D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, Reaction Buffer, PCR Optimizer and Stabilizer, eyi ti o le ṣee lo pẹlu lysis saarin lati ni kiakia ati irọrun ri awọn ayẹwo, ati ki o ni awọn abuda kan ti ga ifamọ, pato ati iduroṣinṣin.

    Awọn ẹya ara ẹrọ ọja

    Irọrun, imọ-ẹrọ Cell Direct RT ti o munadoko ti o gba diẹ bi iṣẹju 7 lati gba awọn ayẹwo RNA.

    Awọn ibeere ayẹwo jẹ kekere, ati pe o kere ju awọn sẹẹli gbin 10 le ṣee lo fun idanwo.

    Iṣagbejade giga fun gbigba iyara RNA ti awọn sẹẹli ti o gbin bii 384, 96, 24, 12, ati awọn awo-daraga 6.

    Eraser DNA ni anfani lati yara yọ awọn genomes ti a tu silẹ, dinku ipa pupọ lori awọn abajade esiperimenta ti o tẹle.

    Iṣapeye RT ati awọn ọna ṣiṣe qPCR jẹ ki igbesẹ meji-meji RT-PCR ṣiṣẹ pẹlu iwe-kikọ yiyipada daradara diẹ sii, pato, ati ifarada inhibitor ifasẹyin RT-qPCR ti o lagbara.

    Ohun elo Kit

    Iwọn ohun elo: Awọn sẹẹli ti o gbin.

    Ayẹwo lysis tumọ RNA: ti a lo nikan bi awoṣe meji-igbesẹ RT-qPCR.

    Awọn ohun elo le ṣee lo fun awọn idi wọnyi: itupalẹ ikosile ilana ilana jiini, idanwo allele, ibojuwo oogun, ati bẹbẹ lọ.

    Awọn idiwọn Kit

    Awọn ajẹkù ti o pọju ≤ 300 bp.

    Awọn ohun elo ni a lo si awọn sẹẹli aṣa tuntun.

    Iṣakoso didara ọja

    Gẹgẹbi Eto Iṣakoso Didara Lapapọ ti FOREGENE, ipele kọọkan ti awọn ohun elo jara Cell Direct RT-qPCR ni idanwo ni lile ni awọn akoko pupọ lati rii daju igbẹkẹle ati iduroṣinṣin ti didara ipele kọọkan ti awọn ohun elo.

    Awọn akoonu inu ohun elo

    QuickEasyTM Ẹyin Taara RT-qPCR Kit-Taqman
    Kit irinše20μl qPCR Reaction System DRT-01021 DRT-01022 Akiyesi
    200 T 1000 T
     

    Apakan I

    Ifipamọ CL 4 milimita 20 milimita  

     

    Cell Lysis

    Foregene Protease Plus II 80 μl 400 milimita
    Buffer ST 400 milimita 1 milimita × 2
     

     

    Apakan II

    DNA eraser 80 μl 400 milimita
    5× Adapọ RT Taara * 160 milimita 800 milimita RT
    2× Taara qPCR Mix-Taqman * 1 milimita × 2 1.7 milimita × 6 qPCR
    20× ROX Itọkasi Dye 40 μl 200 milimita
    RNase-Ọfẹ ddH2O 1.7 milimita 10 milimita

    Ilana itọnisọna

    1 nkan

    1 nkan

    *:Cell Lysis, 5× Direct RT Mix, 2× Direct qPCR Mix-Taqman le ṣee ra lọtọ, awọn alaye ti wa ni Afikun 1 (PAGE 13).

    Awọn ipo ipamọ

    1. Sowo Awọn ipo

    Gbogbo ilana ti gbigbe apoti yinyin iwọn otutu kekere, lati rii daju pe kit wa ni ipo <4 °C.

    2. Awọn ipo ipamọ

    Tọju apakan I ni 4°C ati Apá II ni -20°C.

    Foregene Protease Plus II yẹ ki o wa ni ipamọ ni 4°C, kii ṣe didi ni -20°C.

    Reagent 2× Taara qPCR Mix-Taqman wa ni ipamọ ni -20°C, tabi ni 4°C fun lilo igba diẹ ti a ba lo nigbagbogbo (laarin awọn ọjọ 10).

    Apo alaye paati

    Buffer CL: Pese agbegbe ti o nilo fun awọn aati lysis sẹẹli.

    Buffer ST: Fopin si nkan ti nṣiṣe lọwọ ninu lysate lati yago fun awọn ipa lori RT atẹle.

    Eraser DNA: yiyọ DNA, ipa ti yiyọ jinomii kuro lori awọn adanwo ti o tẹle.

    5 × Direct RT Mix: Ni ibatan RNA giga Foregene Reverse Transcriptase, RNase Inhibitor, dNTPs, stabilizers, enhancers, optimizers, and the transcription primers fun titete to dara julọ (Random Primer, Oligo(dT)18Alakoko).

    Foregene Protease Plus II: Ni aaye ti ifipamọ lysis, awọn sẹẹli ti lysed lati tu awọn acids nucleic silẹ.

    2× Taara qPCR Mix-Taqman: Eleyi reagent ni Gbona D-Taq DNA Polymerase, dNTPs, MgCl2, saarin lenu, PCR optimizer, and stabilizer.

    20 × ROX Reference Dye: Ni gbogbogbo ti a lo lori Awọn ohun elo imudara PCR Real Time ti ABI, Stratagene ati awọn ile-iṣẹ miiran, a lo lati ṣatunṣe iyatọ laarin awọn tubes PCR ati awọn tubes ti o ṣẹlẹ nipasẹ awọn aṣiṣe dosing PCR.Ifojusi Itọkasi Itọkasi 20 × ROX ti o nilo fun awọn ohun elo oriṣiriṣi yatọ, ati pe olumulo le ṣafikun ni ibamu si ifọkansi iṣeduro ti ohun elo naa.

    RNase-Ọfẹ ddH2O: Omi mimọ olekenka ti ko ni aabo RNase fun awọn aati RT-qPCR-igbesẹ meji.

    Àwọn ìṣọ́ra:(Rii daju pe o ka awọn iṣọra ni pẹkipẹki ṣaaju lilo ohun elo naa)

    San ifojusi si ọna išišẹ ti idanwo lati yago fun ibajẹ agbelebu laarin awọn ayẹwo.

    San ifojusi si mimọ ti agbegbe idanwo ati awọn ohun elo lati yago fun ibajẹ RNase ati ibajẹ RNA.

    Mu awọn ayẹwo sẹẹli titun tabi ti o ni aabo daradara ati ki o maṣe lo awọn ayẹwo sẹẹli ti o di didi leralera.

    5× Direct qPCR Mix,2× Direct qPCR Mix-Taqman yẹ ki o yago fun leralera di-thaw, bibẹkọ ti o yoo ni ipa lori yiyipada transcription ati PCR ṣiṣe.

    Igbaradirationsṣaaju ki o toisẹ

    Rii daju lati ka awọn itọnisọna ni pẹkipẹki ṣaaju lilo ohun elo yii.Ohun elo Cell Direct RT-qPCR rọrun, rọrun, ati yara lati ṣiṣẹ, ati pe awọn itọnisọna pese alaye pipe nipa gbogbo ohun elo naa ati bii o ṣe le lo ni deede.Jọwọ mura awọn ohun elo idanwo pataki ati ẹrọ ṣaaju lilo.

    Awọn ohun elo idanwo ati ẹrọ

    ◆ Aṣa ẹyin.

    ◆ 1,5 milimita tabi 2 milimita, RNase-/DNase-Free centrifuge tube, RNase-/DNase-ọfẹ sample, 0,2 milimita sterile qPCR tube.

    ◆ qPCR ẹrọ, pipette, tabletop centrifuge (13.400×g) (da lori esiperimenta aini), ati be be lo.

    Aabo

    ◆ Ọja yii wa fun awọn idi iwadii imọ-jinlẹ nikan, jọwọ ma ṣe lo fun oogun, ile-iwosan, ounjẹ ati awọn idi ohun ikunra.

    ◆ Nigbati o ba nlo awọn kemikali, wọ awọn aṣọ lab ti o yẹ, awọn ibọwọ, awọn gilaasi aabo, ati bẹbẹ lọ.

    Isẹawọn itọsọna

    Awọn ọna ṣiṣe Cell Lysis, awọn eto RT, ati awọn akopọ afikun ifasẹyin idahun qPCR le ṣee ra lọtọ, fun awọn alaye ni Afikun 1 (PAGE 13).

    Itọsọna isẹ

    A: Apeere itusilẹ RNA

    1.Cells won pretreated: Wẹ awo asa sẹẹli pẹlu PBS tutu, lẹhinna lyse awọn sẹẹli (10-10).6), 106 ju iye ti awọn sẹẹli, ti wa ni niyanju Foregene awọn Cell ohun RNA ipinya Apo lapapọ (DE-03111) tabi Animal Total RNA ipinya Apo (DE-03011) fun RNA isediwon ati ìwẹnumọ.

    1.1.Awọn sẹẹli ti o tẹle (awọ daradara 24 bi apẹẹrẹ)

    1.1.1.Ṣe ipinnu nọmba awọn sẹẹli ninu kanga kọọkan, pinnu pe nọmba awọn sẹẹli jẹ 1 × 105, ati lo pipette lati yọ alabọde aṣa kuro ninu satelaiti aṣa.

    1.1.2.Fi 200 μl ti tutu-tutu 1 × PBS si kanga kọọkan.Ma ṣe pipet leralera ki o yọ PBS kuro ninu awọn kanga.Pulọọgi awọn awo ati ki o yọ bi Elo PBS bi o ti ṣee.Tẹsiwaju si igbesẹ 2.

    1.1.3.Satela aṣa sẹẹli oriṣiriṣi tabi tabili nọmba itọkasi 1-1 ninu satelaiti aṣa sẹẹli ni a fi kun precooled 1 × PBS fun fifọ sẹẹli.

    Table1-1: Iwọn lilo PBS fun awọn nọmba oriṣiriṣi ti awọn sẹẹli

    Asa awo iru

    Nọmba ti awọn sẹẹli / daradara

    1 × PBS/ daradara

    6-daradara

    1× 106

    1000 milimita

    12-daradara

    2× 105

    400 milimita

    24-daradara

    105

    200 milimita

    96-daradara

    104

    50 μl

    384-daradara

    5× 103

    25 μl

    Akiyesi:Lati rii daju a duro adherent ẹyin,nọmba nla ti pipadanu sẹẹli yago fun nigba fifọ.

    1.2.Awọn sẹẹli idadoro tabi awọn sẹẹli ifaramọ ti a gbin ni awọn awo ti ko ni la kọja

    1.2.1.Awọn sẹẹli ti o tẹle ti a gbin ni awọn apẹrẹ ti kii-pupọ daradara (awọn sẹẹli idadoro bẹrẹ lati igbesẹ ti n tẹle 1.2.2), gba ati ya awọn sẹẹli naa ni ibamu si ọna gbigba sẹẹli deede, ki o si gbe wọn sinu awo aṣa tabi tube centrifuge;ti a ba lo trypsinization, nilo centrifugation lati gba awọn sẹẹli naa ati lati yọ trypsin ti o ku, ti a fi kun awọn sẹẹli ti a dapadabọ PBS sinu awọn sẹẹli kọọkan lati tuka awọn sẹẹli naa.

    1.2.2.Lẹhin nọmba awọn sẹẹli ti a ka, awọn sẹẹli aliquoted 1 × 105 ọkan si awọn tubes centrifuge, gba awọn sẹẹli nipasẹ centrifugation ni 1000 × g fun iṣẹju 10.

    1.2.3.Fi 200 μl PBS kun si tube centrifuge, ma ṣe pipet leralera, ki o si ṣe itara taara PBS.Tẹsiwaju si igbesẹ 2. (Ti o ba nira lati ṣaju ati pe awọn sẹẹli naa tun tun pada, o le ṣe 1000 × g centrifuged 10 min lẹhin sisọnu supernatant naa, pellet sẹẹli tẹsiwaju si igbesẹ 2)

    2.Cell lysis: Yọ Buffer CL, iwọn otutu rẹ ni ibamu si iwọn otutu, DNA Eraser ati Foregene Protease Plus II, ni ibamu si eto lysis ti a pese sile 1-2: (Lisis ojutu ti šetan fun lilo).

    Table1-2: cleavage igbaradi eto (Akiyesi: ni igbaradi lori yinyin)

    Ẹya ara ẹrọ

    Cell Lysis Titunto Mix)

    6-kanga awo

    12-kanga awo

    24-kanga awo

    96-kanga awo

    384-kanga awo

    1000 μl / daradara

    400 μl / daradara

    200 μl / daradara

    50 μl / daradara

    25 μl / daradara

    Ifipamọ CL

    960μl

    384μl

    192μl

    48μl

    24μl

    DNA eraser

    20μl

    8μl

    4μl

    1μl

    0.5 μl

    Foregene Protease Plus II

    20μl

    8μl

    4μl

    1 μl

    0.5 μl

    3.( 24 -well awo bi apẹẹrẹ ) Pipette 200 μl ti cell lysis master mix sinu kọọkan daradara, leralera fẹ 5-10 igba, Incubate ni yara otutu (20-25 ℃) fun 5 min.

    Akiyesi:Lati yago fun dida awọn nyoju, jọwọ nigbati pipette iwọn pipette ti ni titunse si 200μl tabi kere si.Awọn sẹẹli le han kurukuru lẹhin lysis, eyiti o jẹ deede.

    4. (24 -well awo bi apẹẹrẹ ) ti wa ni afikun ninu omi 20 μl Buffer ST (oriṣiriṣi awọn ọna ṣiṣe lysis Buffer ST ti a fi kun ni iye ti o han ni Table 1-3), tun pipetting 5-10 igba, ni iwọn otutu yara (20-25 ℃) ti wa ni idapo fun 2 min.

    Akiyesi:Itọpa pipette ti o sọnu ni isalẹ ilẹ, ni idaniloju pe a ṣafikun lysate naa,lati yago fun dida awọn nyoju, jọwọ nigbati pipetting pipette asekale ti a titunse si 200μl tabi kere si.

    Table 1-3:Fi saarin ST

    Buffer ST

    6- kanga awo

    12- kanga awo

    24- daradara awo

    96- kanga awo

    384- kanga awo

    100 μl / daradara

    40 μl / daradara

    20 μl / daradara

    5 μl / daradara

    2.5 μl / daradara

    5.The lysate ti wa ni lilo fun tetele RT-qPCR adanwo.Ti awọn adanwo ti o tẹle ko ba le ṣe ni akoko, jọwọ tọju rẹ lori yinyin fun ko ju wakati meji lọ, ki o tọju ni -20 ℃ tabi -80 ℃ (ko si ju oṣu mẹta lọ).

    B: RT igbaradi eto

    1.Take jade 5 × Direct RT Mix ki o si gbe e sori yinyin iwẹ, jẹ ki o yo nipa ti ara, ki o si rọra dapọ fun lilo nigbamii;mu ddH2O ọfẹ RNase jade ki o yo o si gbe e sori yinyin iwẹ fun lilo nigbamii.Mura eto ifaseyin lori yinyin ni ibamu si Table 2-1 ni isalẹ.

    Table 2-1: Igbaradi ti RT lenu eto

    RT eto fi akoonu

    Pẹlu iye

    Ifojusi ikẹhin

    5 × Taara RT Mix

    4μl

    8 μl

    1 ×

    Cell Lysates (awoṣe RNA)

    4 μl

    8 μl

    Ṣafikun atunṣe iwọn

    (10-40%)

    RNase-Ọfẹ ddH2O

    12 μl

    24 μl

    -

    Lapapọ Iwọn didun

    20 μl

    40 μl

    -

    2.After Ipari ti eto igbekalẹ, rọra adalu ati centrifuged ni soki ninu awọn wọnyi tabili 2 -2 lenu ipo RT lenu.

    Table 2-2: RT Reaction majemu eto

    Igbesẹ

    Iwọn otutu

    aago

    akoonu

    1

    42 °C

    15-30 iṣẹju

    cDNA kolaginni

    2

    95 °C

    5 min

    Transscriptase yiyipada ti ko ṣiṣẹ

    3

    4 °C

    N/A

    3.After Ipari ti awọn lenu, awọn lenu ọja ti a gbe taara lori yinyin fun qPCR , jọwọ fi awọn gun-igba itoju -20 ℃ tabi -80 ℃ .

    Akiyesi: Nitori lilo awoṣe ti kii ṣe mimọ, awọn itusilẹ funfun le han ninu ọja ifasilẹhin yiyipada.Eyi jẹ iṣẹlẹ deede.Centrifuge supernatant lẹsẹkẹsẹ fun awọn adanwo ti o tẹle.

    Ojutu esi esi ti RT ni a ṣafikun si atẹle Igbesẹ Real Time PCR awọn ọna ṣiṣe, o ni iṣeduro lati ṣafikun awọn oye ti o wa lati 10-30% ti eto ifaseyin.

    C: igbaradi eto ifaseyin qPCR

    1.Yiyẹ iye ti B pese sile ni igbese cDNA awoṣe ni ibamu si awọn wọnyi tabili 3-1 lati mura a lenu eto.

    Akiyesi: Iye awoṣe cDNA ṣe akọọlẹ fun 10-30% ti eto qPCR.Fun apẹẹrẹ, ninu eto 20μl qPCR kan, ṣafikun 2-6 μl ti ifipamọ lysis, ṣugbọn kii ṣe ju 6 μl.

    2.Awọn iṣapeye ti o dara awọn ipo qPCR (Annealing otutu, ati bẹbẹ lọ) fun ifarapa qPCR (Awọn ipo iṣeduro ti a fun ni Table 3-2).

    Akiyesi: Gbiyanju lati lo awọn ipo iṣapeye fun awọn aati qPCR lati ni awọn abajade to dara julọ.

    Table 3-1: Igbaradi ti PCR lenu eto

    RT eto fi akoonu

    Pẹlu iye

    Ifojusi ikẹhin

    2× Taara qPCR Mix-Taqman 10 μl
    Alakoko siwaju (10μM) 0.4 μl 50-900 nM 1*
    Yipada alakoko (10μM) 0.4 μl 50-900 nM 1*
    Iwadi (10μM) 0.2 μl 200nM
    awoṣe cDNA (ti o gba ni igbesẹ B) 4 μl 10-30%
    RNase-Ọfẹ ddH2O -
    20×ROX Itọkasi Dye 3* - -
    Lapapọ Iwọn didun 20 μl

    1 *: Ifojusi alakoko le ṣe atunṣe ni ibiti o ti 50-900 nM nigbati iṣẹ ifasẹ alakoko ko dara.

    Akiyesi: Eto qPCR le ṣe atunṣe ni ibamu si awọn iwulo idanwo ati awoṣe cycler fluorescence.Fun qPCR ni 50 kanμl eto, ṣatunṣe iwọn lilo reagent ni ibamu ni ibamu si 20μl eto.

    Real akoko PCR ẹrọ ROX Reference Dye ik fojusi
    ABI PRISM7000/7300/7700/7900HT/Igbese Ọkan, ati be be lo. 1× (fun apẹẹrẹ. Eto 20 μl, ṣafikun 1 μl 20 × ROX Itọkasi Dye)
    ABI 7500/7500 Yara ati StratageneMx3000P/Mx3005P/Mx4000, ati be be lo. 0.5×(fun apẹẹrẹ. 20 μl eto,fi 0.5 μl 20×ROX ReferenceDye)

    2 *: Yan ifọkansi ikẹhin ti o yẹ ti Dye Reference ROX ni ibamu si ẹrọ iyipo iwọn otutu fluorescence.Awọn ifọkansi Itọkasi Itọkasi ROX ti o yẹ julọ fun awọn kẹkẹ iwọn fluorescence ti o wọpọ ni a fihan ninu tabili ni isalẹ:

    Table 3-2: qPCR lenu ipo ti wa ni pese

    Igbesẹ Meji

    Iwọn otutu

    Aago

    Awọn iyipo

    Akoonu

    1 95℃ 3 min 1

    Predenaturation

    2 95℃ 5-10 iṣẹju-aaya 40

    Denaturation awoṣe

    3 60-65 ℃ 20-30 iṣẹju-aaya

    Annealing / Itẹsiwaju

    Akiyesi: Lati le gba ipa qPCR ti o dara julọ, PCR gradient le ṣee lo lati mu awọn ipo ifaseyin pọ si fun awọn awoṣe oriṣiriṣi ati awọn alakoko oriṣiriṣi.Awọn ipo ifaseyin PCR yatọ si da lori olutupa fluorescence, awoṣe, alakoko, bbl Ninu iṣiṣẹ kan pato, awọn ipo ifasẹyin ti o dara julọ nilo lati ṣe apẹrẹ ni ibamu si awọn ipo kan pato ti cycler fluorescence quantitative thermal cycler, iru awoṣe, iwọn ti ajẹku ti iwulo, ọkọọkan ipilẹ ti ajẹku ti o pọ si ati akoonu GC ati gigun ti awọn alakoko, pẹlu iwọn otutu akoko.

    Real Time PCR alakoko oniru agbekale

    Siwaju Alakoko ati Yiyipada Alakoko

    Fun Real Time PCR, apẹrẹ alakoko jẹ pataki pupọ.Awọn alakoko jẹ ibatan si pato ati ṣiṣe ti imudara PCR, ati pe o le ṣe apẹrẹ pẹlu itọkasi awọn ipilẹ wọnyi:

    ◆ Ipari gigun: 18-30bp.

    ◆ GC akoonu: 40-60%.

    ◆ Tm iye: sọfitiwia apẹrẹ alakoko, gẹgẹbi alakoko 5, le fun iye Tm ti alakoko.Awọn iye Tm ti oke ati isalẹ awọn alakoko yẹ ki o wa ni isunmọ bi o ti ṣee ṣe.Ilana iṣiro Tm tun le ṣee lo: Tm = 4 °C (G + C) + 2 °C (A + T).Nigbati o ba n ṣiṣẹ PCR, iwọn otutu ti o wa ni isalẹ iye Tm alakoko ti 5 °C ni a yan ni gbogbogbo bi iwọn otutu annealing (ilosoke ti o baamu ni iwọn otutu annealing le mu iyasọtọ ti iṣe PCR pọ si).

    ◆ Awọn alakoko ati awọn ọja PCR:

    ◆ Design alakoko PCR ipari ọja ipari jẹ pelu 100-150bp.

    ◆ Awọn alakoko apẹrẹ ni agbegbe igbekalẹ Atẹle ti awoṣe yẹ ki o yago fun bi o ti ṣee ṣe.

    ◆ Yago fun dida 2 tabi diẹ ẹ sii awọn ipilẹ ibaramu laarin awọn opin 3′ ti oke ati awọn alakoko isalẹ.

    ◆ Alakoko 3′ ipilẹ ebute ko le wa pẹlu 3 afikun itẹlera G tabi C.

    ◆ Awọn alakoko funrara wọn ko le ni awọn ẹya ibaramu, bibẹẹkọ eto irun-awọ kan yoo ṣẹda, ni ipa lori imudara PCR.

    ◆ ATCG yẹ ki o pin kaakiri bi o ti ṣee ṣe ni ọna alakoko, ati ipilẹ 3′ ebute yẹ ki o yago fun bi T.

    Àfikún1:Cell DirectRT-qPCR Apo kompont afikun akopọ

    1.Cell Lysis Solusan


    Cell Lysis Solusan

    Awọn paati ohun elo

    (24-daraga lysis eto / daradara)

    DRT-01011-A1

    DRT-01011-A2

    100 T

    500 T

    ApakanI

    Ifipamọ CL

    20 milimita

    100 milimita

    Foregene Protease Plus II

    400 milimita

    1 milimita × 2

    Buffer ST

    1 milimita × 2

    10 milimita

    ApakanII

    DNA eraser

    400 milimita

    1 milimita × 2

     

    2.RT Mix


    Apapo RT

    Awọn paati ohun elo

    (20 μl eto esi)

    DRT-01011-B1

    200 T

    5× Taara RT Mix

    800 milimita

    RNase-Ọfẹ ddH2O

    1.7 milimita × 2

    3.qPCR Mix


    qPCR Apapo

    Awọn paati ohun elo

    (20 μl eto esi)

    DRT-01021-C1

    DRT-01021-C2

    200 T

    1000 T

    2× Taara qPCR Mix-Taqman

    1 milimita × 2

    1.7 milimita × 6

    20× ROX Itọkasi Dye

    40 μl

    200 milimita

    RNase-Ọfẹ ddH2O

    1.7 milimita

    10 milimita

    World ká Foregene

    Foregene Co., Ltd

    Tẹli: 028-83360257,028-83361257

    E-mail :info@foregene.com

    Http://www.foregene.com

    Kọ ifiranṣẹ rẹ nibi ki o si fi si wa