1. Ibẹrẹ oye
Ni ipele yii, a nilo lati ni oye diẹ ninu awọn imọran ati awọn ọrọ-ọrọ, nitorinaa lati yago fun ṣiṣe awọn aṣiṣe ni iwaju awọn agbalagba wa, bii:
Q: Kini iyatọ laarin RT-PCR, qPCR, PCR akoko gidi, ati RT-PCR akoko gidi?
Idahun: RT-PCR jẹ PCR transcription yiyipada(PCR transcription yiyipada, RT-PCR), eyiti o jẹ iyatọ ti a lo lọpọlọpọ ti iṣesi pq polymerase (PCR).Ni RT-PCR, okun RNA ti wa ni yiyipada si kikọ DNA ti o ni ibamu, eyiti a lo bi awoṣe fun imudara DNA nipasẹ PCR.
Real-akoko-PCR ati qPCR(Quantitative Rea-ltime-PCR) jẹ ohun kanna, mejeeji jẹ PCR pipo gidi-akoko, eyiti o tumọ si pe ọmọ kọọkan ti PCR ni awọn igbasilẹ data akoko gidi, nitorinaa nọmba awọn awoṣe ibẹrẹ le ṣe atunṣe itupalẹ deede.
Botilẹjẹpe mejeeji PCR gidi-akoko (PCR fluorescent pipo gidi-akoko) ati PCR transcription yiyipada (PCR transcription yiyipada) dabi ẹni pe o jẹ abbreviated bi RT-PCR, apejọ kariaye jẹ: RT-PCR ni pataki tọka si iyipada transcriptionPCR, PCR-akoko gidi jẹ abbreviated bi qPCR (pipo akoko gidi PCR).
Ati RT-PCR gidi-akoko (RT-qPCR), O jẹ PCR transcription yiyipada ni idapo pẹlu imọ-ẹrọ pipo Fuluorisenti: akọkọ gba cDNA (RT) lati RNA yiyipada transcription, ati ki o si lo Real-akoko PCR fun pipo onínọmbà (qPCR).Pupọ awọn ile-iṣọ ṣe RT-qPCR, iyẹn ni, iwadii lori ilana ikosile RNA, nitorinaa qPCR ti gbogbo eniyan n sọrọ nipa ninu yàrá gangan tọka si RT-qPCR, ṣugbọn maṣe gbagbe pe ọpọlọpọ awọn idanwo DNA tun wa ni awọn ohun elo ile-iwosan.Ayẹwo pipo, gẹgẹbi wiwa HBV kokoro jedojedo.
Ibeere: Lẹhin kika pipọ pipo fluorescent pipo PCR, kilode ti ajẹku ti o pọ si ni iṣakoso laarin iwọn 80-300bp?
Idahun: Awọn ipari ti kọọkan ọkọọkan ti o yatọ si, diẹ ninu awọn ni o wa ni ọpọlọpọ awọn kb, diẹ ninu awọn ni o wa ogogorun ti bp, sugbon a nikan nilo awọn ọja ipari lati wa ni 80-300bp nigba ti nse awọn alakoko, kuru ju tabi gun ju ko dara fun fluorescent pipo PCR erin .Ajẹkù ọja naa kuru ju lati ṣe iyatọ si alakoko-dimer.Gigun alakoko-dimer jẹ nipa 30-40bp, ati pe o ṣoro lati ṣe iyatọ boya o jẹ alakoko-dimer tabi ọja ti o ba kere ju 80bp.Ti ajẹkù ọja ba gun ju, ti o kọja 300bp, yoo ni irọrun ja si iṣẹ ṣiṣe ampilifaya kekere ati pe ko le rii iye jiini ni imunadoko.
Fun apẹẹrẹ, nigba ti o ba ka iye eniyan ti o wa ninu yara ikawe, iwọ nikan nilo lati ka iye ẹnu ti o wa.Bakan naa ni otitọ nigba ti o ba rii awọn Jiini, iwọ nikan nilo lati wa ọkọọkan kan ti jiini lati ṣe aṣoju Gbogbo ọkọọkan yoo ṣe.Ti o ba fẹ ka eniyan, o nilo lati ka ẹnu ati imu mejeeji, eti, ati awọn gilaasi, ati pe o rọrun lati ṣe awọn aṣiṣe.
Lati faagun, ni awọn iwadii ti ẹkọ nipa ti ibi, ọpọlọpọ awọn ọran iwadii wa lati aaye si agbegbe, nitori ilana-jiini ti eyikeyi iru jẹ pipẹ pupọ, ko ṣe pataki ati pe ko ṣee ṣe lati wiwọn gbogbo awọn ajẹkù, gẹgẹ bi ilana 16S ti kokoro-arun, eyiti o jẹ lati ṣe ilana Konsafetifu ti awọn ayẹwo kokoro-arun lati sọ nọmba kan ti olugbe kan ti kokoro arun.
Q: Kini ipari ti o dara julọ fun apẹrẹ alakoko qPCR?
Idahun: Ni gbogbogbo, ipari alakoko jẹ nipa 20-24bp, eyiti o dara julọ.Nitoribẹẹ, a gbọdọ san ifojusi si iye TM ti alakoko nigba ti n ṣe apẹrẹ alakoko, nitori eyi ni ibatan si iwọn otutu annealing ti o dara julọ.Lẹhin ọpọlọpọ awọn adanwo, o ti fihan pe 60°C jẹ iye TM ti o dara julọ.Ti iwọn otutu annealing ba kere ju, yoo ni irọrun ja si imudara ti kii ṣe pato.Ti iwọn otutu annealing ba ga ju, ṣiṣe imudara yoo jẹ kekere diẹ, tente oke ti ohun ti tẹ ampilifaya yoo bẹrẹ nigbamii, ati pe iye CT yoo ni idaduro.
Q: Bawo ni ọna awọ ṣe yatọ si ọna iwadi?
Idahun: Ọna DyeDiẹ ninu awọn dyes Fuluorisenti, gẹgẹbi SYBR Green Ⅰ, PicoGreen, BEBO, ati bẹbẹ lọ, ko ṣe tan ina funrara wọn, ṣugbọn yoo tan imọlẹ fluorescence lẹhin ti o so mọ iho kekere ti DNA ti o ni okun meji.Nitorinaa, ni ibẹrẹ ti iṣe PCR, ẹrọ naa ko le rii ifihan agbara Fuluorisenti.Nigbati iṣesi ba de ipele ifaagun-imura, okun ilọpo meji yoo ṣii, ati okun tuntun ti wa ni iṣelọpọ labẹ iṣẹ ti DNA polymerase, ati pe molikula Fuluorisenti naa so mọ iho kekere dsDNA.Bi nọmba awọn iyika PCR ṣe n pọ si, awọn awọ diẹ sii ati siwaju sii ni idapo pẹlu DNA ti o ni ilopo meji, ati ifihan agbara fluorescent tun ni ilọsiwaju nigbagbogbo.Ọna awọ jẹ lilo ni pataki ninu iwadii imọ-jinlẹ.
PS: Ṣọra nigbati o ba ṣe idanwo naa, awọ naa ni lati ni idapo pelu DNA eniyan, ṣọra lati yi pada si eniyan fluorescent.
Ọna Dye (osi) Ọna iwadii (ọtun)
PS: Ṣọra nigbati o ba ṣe idanwo naa, awọ naa ni lati ni idapo pelu DNA eniyan, ṣọra lati yi pada si eniyan fluorescent.
SYBR Green Ⅰ sopọ mọ iho kekere ti DNA
Ọna iwadiiIwadii Taqman jẹ iwadii hydrolysis ti o wọpọ julọ.Ẹgbẹ Fuluorisenti kan wa ni opin 5′ ti iwadii naa, nigbagbogbo FAM, ati pe iwadii funrararẹ jẹ itọsẹ lẹsẹsẹ si jiini ibi-afẹde.Ẹgbẹ ti npa Fuluorisenti wa ni ipari 3′.Ni ibamu si awọn opo ti Fuluorisenti resonance gbigbe agbara (Förster resonance agbara gbigbe, FRET), nigbati awọn onirohin Fuluorisenti ẹgbẹ (oluranlọwọ Fuluorisenti moleku) ati awọn quenching Fuluorisenti ẹgbẹ (acceptor Fuluorisenti moleku) ni o wa yiya Nigbati awọn sipekitira ni lqkan ati awọn ijinna jẹ gidigidi sunmo (7-10nm ti awọn moleku ti awọn ẹbun), excuser molecule ti awọn ẹbun le gba). moleku, nigba ti autofluorescence jẹ alailagbara.Nitorinaa, ni ibẹrẹ ti iṣesi PCR, nigbati iwadii ba wa ni ọfẹ ati mule ninu eto naa, ẹgbẹ fluorescent ti onirohin kii yoo tan imọlẹ.Nigbati o ba n parẹ, alakoko ati iwadii naa so mọ awoṣe naa.Lakoko ipele itẹsiwaju, polymerase n ṣepọ awọn ẹwọn tuntun nigbagbogbo.DNA polymerase ni iṣẹ-ṣiṣe 5'-3' exonuclease.Nigbati o ba de iwadi naa, DNA polymerase yoo ṣe hydrolyze iwadi naa lati inu awoṣe, ya ẹgbẹ fluorescent ti onirohin kuro lati ẹgbẹ fluorescent quencher, ki o si tu ifihan agbara fluorescent silẹ.Niwọn igba ti ibatan ọkan-si-ọkan wa laarin iwadii ati awoṣe, ọna iwadii ga julọ si ọna dai ni awọn ofin ti deede ati ifamọ ti idanwo naa.Ọna iwadii ni a lo ni pataki ni iwadii aisan.
Q: Kini idiiwọn pipe?Kini Isọdi ibatan?
Idahun: Idiwọn pipe n tọka si iṣiro nọmba ẹda akọkọ ti ayẹwo lati ṣe idanwo nipasẹ qPCR, gẹgẹbi iye awọn ọlọjẹ HBV ti o wa ninu 1ml ti ẹjẹ.Abajade ti o gba nipasẹ titobi ojulumo ni iyipada ninu iye jiini ibi-afẹde ni apẹẹrẹ kan pato ti o ni ibatan si apẹẹrẹ itọkasi miiran, ati pe ikosile pupọ jẹ ilana-oke tabi ilana-isalẹ.
Ibeere: Njẹ iye isediwon RNA, iṣẹ ṣiṣe transcription yiyipada, ati imudara imudara yoo ni ipa lori awọn abajade esiperimenta?
Q: Ṣe ibi ipamọ ayẹwo, awọn atunmọ isediwon, awọn atunto transcription, ati awọn ohun elo gbigbe ina ni ipa awọn abajade esiperimenta?
Q: Ọna wo ni o le ṣe atunṣe data idanwo naa?
Nipa awọn ọran wọnyi, a yoo ṣe apejuwe wọn ni awọn alaye ni awọn apakan ti ilọsiwaju ati ilọsiwaju ni isalẹ.
2. Imọ to ti ni ilọsiwaju
Pẹlu iyi si PCR pipo Fuluorisenti gidi-gidi, a gbọdọ mọ otitọ pe ẹgbẹẹgbẹrun awọn iwe iwadii imọ-jinlẹ ni a gbejade ni gbogbo ọdun, laarin eyiti imọ-ẹrọ pipo PCR fluorescent kii ṣe nọmba kekere kan.
Ti ko ba si boṣewa ti o wọpọ lati wiwọn idanwo pipo Fuluorisenti PCR, awọn abajade le yatọ lọpọlọpọ.Fun Jiini kanna ti eya kanna, pẹlu ọna ṣiṣe kanna, awọn abajade wiwa yoo tun yatọ pupọ, ati pe yoo nira fun awọn ti o pẹ lati tun awọn abajade kanna ṣe.Iwọ Ko si ẹniti o mọ eyi ti o tọ ati eyi ti ko tọ.
Ṣe eyi tumọ si pe PCR pipo fluorescent jẹ imọ-ẹrọ iyanjẹ tabi imọ-ẹrọ ti ko gbẹkẹle?Rara, o jẹ nitori Fuluorisenti pipo PCR jẹ diẹ kókó ati siwaju sii deede, ati kekere kan ti ko tọ si isẹ ti yoo gbe awọn patapata idakeji esi.Ipadanu kekere kan jẹ ẹgbẹrun kilomita kuro.Onkọwe nkan naa le jẹ ijiya leralera nipasẹ awọn oluyẹwo.Ni akoko kanna, awọn oluyẹwo ti iwe-akọọlẹ tun nira lati yan lati awọn abajade esiperimenta oriṣiriṣi.
Ni gbogbo rẹ, n tọka si aini isokan ni awọn adanwo PCR akoko gidi.Ni ipari yii, awọn onimọ-jinlẹ giga ninu ile-iṣẹ bẹrẹ lati ṣe agbekalẹ awọn iṣedede,nilo awọn oluranlọwọ lati pese diẹ ninu idanwo pataki ati awọn alaye sisẹ data (pẹlu data pataki) ninu nkan lati pade awọn iṣedede wọnyi.
Awọn oluyẹwo le ṣe idajọ didara idanwo naa nipa kika awọn alaye wọnyi;ojo iwaju onkawe si tun le lo eyi lati tun ṣàdánwò tabi mu awọn ṣàdánwò.Lẹhinna awọn abajade esiperimenta ti o gba ni ọna yii kun fun alaye, didara giga, ati lilo.
MIBBI (Iwifun ti o kere julọ fun Awọn iwadii Ẹmi ati Imọ-iṣe -http://www.mibbi.org) wa sinu jije.MIBBI jẹ ise agbese kan ti o pese awọn ajohunše fun awọn adanwo.O ti wa ni atejade ni iseda.Ise agbese yii ni ifọkansi si ọpọlọpọ awọn adanwo ti ibi, pẹlu isedale sẹẹli, Microarray, qPCR a yoo jiroro ni bayi, ati bẹbẹ lọ, ati pese fun iru idanwo kọọkan nigbati o ba fi awọn iwe afọwọkọ silẹ.Alaye naa yẹ ki o pese ni gbogbo igba.
Ninu iṣẹ akanṣe MIBBI, awọn nkan meji wa ti o ni ibatan si PCR pipo fluorescent, eyun:
RDML (Ede Siṣamisi data PCR-akoko gidi) – ede ti a ṣeto ati itọsọna ijabọ fun data PCR pipo akoko gidi;
· MIQE (Iwifun Kere fun Titẹjade Awọn Idanwo PCR Akoko Gidi-gidi) – alaye ti o kere julọ fun awọn nkan titẹjade nipa awọn adanwo PCR pipo gidi-akoko.
Ni akọkọ, jẹ ki a sọrọ nipa RDML, sipesifikesonu awọn ọrọ-ọrọ.
Ti ko ba si asọye boṣewa fun ohun gbogbo, ko ṣee ṣe lati tẹsiwaju ijiroro, eyiti o jẹ idi ti alaye ti awọn ofin ṣe pataki ninu idanwo naa.
Awọn ọrọ-ọrọ ti a lo ninu idanwo pipo fluorescent pipo PCR pẹlu akoonu atẹle naa.QIAGEN ti ṣe akopọ ti o dara julọ fun wa.Awọn wọnyi ni gbogbo gbẹeru .
Amúṣantóbi ti tẹ
Iwọn imudara n tọka si ohun ti a ṣe lakoko ilana PCR, pẹlu nọmba ọmọ bi abscissa ati kikankikan fluorescence gidi-akoko lakoko iṣesi bi ordinate.
Ohun ti o tayọ ampilifaya ti tẹ yẹ ki o ni awọn wọnyi abuda: ipilẹṣẹ jẹ alapin tabi dinku diẹ, ati pe ko si aṣa ti o han gbangba;ojuami inflection ti awọn ti tẹ jẹ ko o, ati awọn ite ti awọn exponential alakoso ni iwon si awọn ampilifaya ṣiṣe.Ti o tobi ite naa, ti o ga julọ ṣiṣe imudara;awọn ìwò ampilifaya ti tẹ The parallelism dara, o nfihan pe awọn ampilifaya ṣiṣe ti kọọkan tube ni iru;ipele ipilẹṣẹ ti iwọn imudara ti awọn ayẹwo ifọkansi kekere jẹ kedere.
Ipilẹṣẹ (Ipilẹṣẹ)
Ipilẹṣẹ jẹ ipele ariwo ti ibẹrẹ akoko, nigbagbogbo ni iwọn laarin awọn 3rd ati 15th ọmọ, nitori awọn fluorescence iye ilosoke ṣẹlẹ nipasẹ awọn ampilifaya ọja ko le ṣee wa-ri nigba asiko yi.Nọmba awọn iyipo ti a lo lati ṣe iṣiro ipilẹ le jẹ iyatọ ati pe o le nilo lati dinku ti awọn iwọn awoṣe giga ba lo tabi ti ipele ikosile ti jiini ibi-afẹde ba ga.
Ṣiṣeto ipilẹ-ipilẹ nilo wiwo data fluorescence lati ọna imudara laini.A ti ṣeto ipilẹ-ipilẹ ki idagba ti iha ampilifaya bẹrẹ pẹlu nọmba ọmọ ti o tobi ju nọmba oke ọmọ ipetele lọ.Awọn ipilẹ ile nilo lati ṣeto ni ẹyọkan fun ọkọọkan ibi-afẹde kọọkan.Awọn iye fluorescence apapọ ti a rii ni awọn akoko ibẹrẹ nilo lati yọkuro lati awọn iye fluorescence ti o gba ninu awọn ọja ti o pọ si.Awọn ẹya tuntun ti ọpọlọpọ sọfitiwia PCR Akoko-gidi gba iṣapeye adaṣe ti awọn eto ipilẹṣẹ fun awọn ayẹwo kọọkan.
Lakoko awọn akoko diẹ akọkọ ti iṣe imudara PCR, ifihan agbara fluorescence ko yipada pupọ.Isunmọ laini ti o tọ ni a npe ni ipilẹṣẹ, ṣugbọn ti a ba wo ni pẹkipẹki ni awọn akoko diẹ akọkọ, a rii pe laarin ipilẹsẹ ni ohun ti n ṣẹlẹ ni aworan ni isalẹ.
Background Background ntokasi si
iye fluorescence ti kii ṣe pato ninu iṣesi.Fun apẹẹrẹ: ailagbara fluorescence quenching;tabi nọmba nla ti awọn awoṣe DNA ti o ni ilopo meji nitori lilo SYBR Green.Awọn paati abẹlẹ ti ifihan naa ni a yọkuro ni mathematiki nipasẹ sọfitiwia PCR gidi-akoko.
Onirohin ifihan agbara
Ifihan agbara onirohin n tọka si ifihan agbara Fuluorisenti ti ipilẹṣẹ nipasẹ SYBR Green tabi ti aami fluorescently leralera-pato awọn iwadii lakoko PCR Real-Time.
Ifihan agbara Onirohin deede (RN)
RN n tọka si kikankikan fluorescence ti awọ onirohin ti o pin nipasẹ kikankikan fluorescence ti awọ itọkasi palolo ti a ṣewọn ni iyipo kọọkan.
Palolo Reference Dye
Ni diẹ ninu awọn PCR-akoko gidi,Dye Fuluorisenti ROX ti lo bi itọkasi inu lati ṣe deede ifihan agbara Fuluorisenti.O ṣe atunṣe fun awọn iyatọ nitori pipetting ti ko tọ, ipo daradara, ati awọn iyipada fluorescence lori ipilẹ-daradara daradara.
Ibalẹ fluorescence (ilana)
ni titunse loke iye ẹhin ati ni pataki ni isalẹ iye Plateau ti ohun ti tẹ titobi.O gbọdọ dubulẹ ni agbegbe laini ti iha ampilifaya, ti o nsoju sakani laini log ti wiwa PCR.O yẹ ki o ṣeto awọn iloro ni iwo-itẹ-ipari log-ampilifaya ki apakan log-linear ti PCR jẹ idanimọ ni irọrun.Ti ọpọlọpọ awọn Jiini ibi-afẹde ba wa ni PCR Akoko-gidi, iloro gbọdọ wa ni ṣeto fun ibi-afẹde kọọkan.Ni gbogbogbo, ifihan agbara fluorescence ti awọn akoko 15 akọkọ ti ifa PCR ni a lo bi ifihan isale fluorescence, ati pe ala fluorescence jẹ awọn akoko 10 ti iyasọtọ boṣewa ti ifihan fluorescence ti akọkọ 3 si 15 cycles ti PCR, ati ilodi fluorescence ti ṣeto ni ipele iwọn PCRl.Ni gbogbogbo, ohun elo kọọkan ni ala-ilẹ fluorescence ti ṣeto ṣaaju lilo.
Ibawọn Yiyika (CT) tabi Aaye Líla (CP)
Yiyi ni eyiti ohun ti tẹ ampilifaya kọja iloro (ie, aaye nibiti wiwa fluorescence n pọ si ni pataki).CT le jẹ ida kan ati pe iye awoṣe ibẹrẹ le ṣe iṣiro.Iwọn CT ṣe aṣoju nọmba awọn iyika ti o ni iriri nigbati ifihan Fuluorisenti ninu tube ifasẹyin PCR kọọkan de opin ti a ṣeto.Ibasepo laini wa laarin iye CT ti awoṣe kọọkan ati logarithm ti nọmba ẹda akọkọ ti awoṣe naa,ti o ga awọn ni ibẹrẹ daakọ nọmba, awọn kere awọn CT iye, ati idakeji.Iyipada boṣewa le ṣee ṣe nipasẹ lilo boṣewa kan pẹlu nọmba ẹda akọkọ ti a mọ, ninu eyiti abscissa duro fun iye CT, ati pe ordinate duro fun logarithm ti nọmba ẹda akọkọ.Nitorinaa, niwọn igba ti iye CT ti apẹẹrẹ ti a ko mọ ti gba, nọmba ẹda akọkọ ti apẹẹrẹ le ṣe iṣiro lati iṣipopada boṣewa.
iye ΔCT
ΔCT iye sapejuweiyatọ laarin apilẹṣẹ ibi-afẹde ati iye CT itọka endogenous ti o baamu, gẹgẹbi jiini ipamọ ile, ati pe a lo lati ṣe deede iye awoṣe ti a lo:
⇒ΔCT = CT (jiini ibi-afẹde) - CT (jiini itọkasi inu)
Iye ΔΔCT
Iwọn ΔΔCT ṣe apejuwe iyatọ laarin iwọn ΔΔCT iye ti apẹẹrẹ ti iwulo (fun apẹẹrẹ, awọn sẹẹli ti a mu) ati iye ΔΔCT ti apẹẹrẹ itọkasi (fun apẹẹrẹ, awọn sẹẹli ti ko ni itara).Apeere itọkasi ni a tun pe ni apẹẹrẹ isọdiwọn ati gbogbo awọn ayẹwo miiran jẹ deede si eyi fun titobi ibatan:
⇒ΔΔCT = apapọ ΔCT (apẹẹrẹ ti iwulo) - apapọ ΔCT (apẹẹrẹ itọkasi)
Awọn Jiini itọkasi endogenous (awọn jiini itọkasi inu)
Awọn ipele ikosile ti awọn jiini itọkasi ailopin, gẹgẹbi awọn jiini itọju ile (awọn jiini itọju ile), ko yatọ laarin awọn ayẹwo.Ifiwera awọn iye CT ti jiini itọkasi si jiini ibi-afẹde ngbanilaaye ipele ikosile ti jiini ibi-afẹde lati jẹ deede si iye RNA igbewọle tabi cDNA (wo apakan lori awọn iye ΔCT loke).
Ti abẹnu itọkasi Jiini ti o tọ funibajẹ RNA ti o ṣee ṣe tabi wiwa awọn inhibitors enzymu ninu awọn ayẹwo RNA, bakanna bi awọn iyatọ ninu akoonu RNA, ṣiṣe iyipada iyipada, imularada acid nucleic, ati mimu ayẹwo.Lati yan jiini itọkasi to dara julọ, a ṣe atunṣe algoridimu lati gba yiyan ti itọkasi to dara julọ ti o da lori eto adanwo.
Iṣakoso inu
Ọkọọkan iṣakoso ti o jẹ imudara ni iṣesi kanna bi ọna ibi-afẹde ati ṣewadii pẹlu iwadii oriṣiriṣi (ie, ṣiṣe PCR duplex).Awọn iṣakoso inu nigbagbogbo ni a lo lati ṣe akoso jade awọn ampilifaya ti o kuna, gẹgẹbi nigbati a ko rii ọna ibi-afẹde.
Apeere odiwọn
Apeere itọkasi kan (fun apẹẹrẹ, RNA ti a sọ di mimọ lati laini sẹẹli tabi àsopọ) ti a lo ni iwọn ojulumo lati ṣe afiwe gbogbo awọn ayẹwo miiran lati pinnu ipele ikosile ibatan ti jiini kan.Ayẹwo isọdiwọn le jẹ apẹẹrẹ eyikeyi, ṣugbọn nigbagbogbo jẹ iṣakoso (fun apẹẹrẹ, apẹẹrẹ ti a ko tọju tabi apẹẹrẹ lati odo akoko ti idanwo naa).
Awọn iṣakoso to dara
lo Iṣakoso aati pẹlumọ oye ti awoṣe.Awọn iṣakoso to dara ni a maa n lo nigbagbogbo lati ṣayẹwo pe eto alakoko tabi eto-iwadii n ṣiṣẹ daradara ati pe a ti ṣeto iṣesi ni deede.
Ko si Iṣakoso Awoṣe (NTC)
Iṣeduro iṣakoso ti o ni gbogbo awọn paati pataki ti ifasilẹ imudara ayafi awoṣe, eyiti a rọpo nigbagbogbo pẹlu omi.Lilo NTC le rii idoti ti o ṣẹlẹ nipasẹ ibajẹ reagent tabi DNA ajeji, nitorinaa aridaju ododo ati igbẹkẹle ti data wiwa.Imudara ti iṣakoso NTC tọkasi ibajẹ.
Ko si iṣakoso RT (NRT)
Ilana isediwon RNA le ni DNA genomic ti o ku, eyiti o jẹ ipalara pupọ ati pe o jẹ ẹlẹbi ti o kan didara data ati ọta adayeba ti qPCR, nitorinaa nigbati o ba n ṣe awọn adaṣe, o gbọdọ ṣe apẹrẹ lati mu wiwa RNA pọ si nikan.Awọn ọna meji wa, ọkan ni lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko kọja awọn introns, ekeji ni lati yọ DNA kuro patapata, eyi ti o dara julọ, eyi ti yoo jiroro nigbamii.Iṣakoso NTR jẹ digi idan lati ṣawari idoti DNA.Ti afikun ba wa, o tumọ si pe idoti wa.
Awọn ajohunše
Awọn iṣedede jẹ awọn apẹẹrẹ ti ifọkansi ti a mọ tabi nọmba ẹda ti a lo lati ṣe agbero iwọnwọn kan.Lati rii daju iduroṣinṣin ti boṣewa, ajẹkù jiini nigbagbogbo jẹ cloned sinu plasmid ati lo bi boṣewa.
Awọn boṣewa ti tẹ
Nigbagbogbo a ti fomi sinu o kere ju awọn gradients ifọkansi 5 pẹlu ọja boṣewa ni ibamu si ipin ilọpo meji, ati pe awọn aaye 5 ni a fa ni awọn ipoidojuko ti iye CT ati nọmba ẹda, ati pe awọn aaye ti sopọ lati ṣe laini kan lati ṣe agbekalẹ ti tẹ boṣewa kan.Fun ọna kika boṣewa kọọkan, iwulo rẹ nilo lati ṣayẹwo.Iye ite naa ṣubu laarin -3.3 ati -3.8, ati ifọkansi kọọkan ni a ṣe ni ilọpo mẹta.Awọn aaye ti o yatọ si pataki si awọn aaye miiran yẹ ki o danu.Iwọn CT ti ayẹwo lati ṣe idanwo ni a mu wa sinu ọna kika boṣewa, ati ipele ikosile ti ayẹwo lati ṣe idanwo le ṣe iṣiro.
Iye CT ti ayẹwo lati ṣe idanwo ni a mu wa sinu ọna kika boṣewa, ati pe nọmba ẹda akọkọ ti apẹẹrẹ lati ṣe idanwo le ṣe iṣiro.
Ṣiṣe ati Ite
Ite ti ọna kika boṣewa duro fun ṣiṣe ti PCR akoko gidi.
· Ite ti -3.322 tọkasi pe ṣiṣe imudara PCR jẹ 1, tabi 100% daradara, ati iye ọja PCR ni ilọpo meji ni iyipo kọọkan.
Ite ti o kere ju -3.322 (fun apẹẹrẹ, -3.8) tọkasi ṣiṣe PCR kan
Ite ti o tobi ju -3.322 (fun apẹẹrẹ, -3.0) tọka si pe iṣẹ ṣiṣe PCR yoo han pe o tobi ju 100% lọ, eyiti o jẹ iyanilenu, bawo ni ọmọ PCR kan ṣe le ṣe diẹ sii ju ilọpo meji ọja ti o pọ si?Ipo yii waye ni ipele ti kii ṣe laini ti iṣesi PCR, iyẹn ni, iye nla ti imudara ti kii ṣe pato.
yo ti tẹ
Lẹhin imudara qPCR ti pari, ọja PCR ti gbona.Bi iwọn otutu ti n dide, ọja imufidi-okun ni ilopo yo diėdiẹ, ti o fa idinku ninu kikankikan fluorescence.Nigbati iwọn otutu kan (Tm) ba de, nọmba nla ti awọn ọja yoo yo.Fluorescence silė ndinku.Awọn ọja PCR oriṣiriṣi ni awọn iye Tm oriṣiriṣi ati awọn iwọn otutu yo yatọ, ki pato PCR le ṣe idanimọ.
Ipò yíyọ (ìtẹ̀jáde)
Yiyọ ti tẹ ti wa ni yo lati fẹlẹfẹlẹ kan ti tente maapu, eyi ti o le diẹ intuitively han awọn ipo ti PCR ọja ajẹkù.Niwọn igba ti iwọn otutu yo jẹ iye Tm ti ajẹkù DNA, diẹ ninu awọn paramita ti o ni ipa lori iye Tm ti ajẹkù DNA ni a le ṣe idajọ, gẹgẹbi iwọn ajẹkù, akoonu GC, ati bẹbẹ lọ ni gbogbogbo, ni ibamu si awọn ipilẹ apẹrẹ alakoko wa,ipari ti ọja imudara wa ni iwọn 80-300bp, nitorinaa otutu otutu yẹ ki o wa laarin 80°C ati 90°C.
Itumọ ti yo ti tẹ: Ti tente akọkọ nikan ba han laarin 80 ° C-90 ° C, o tumọ si pe PCR pipo Fuluorisenti jẹ pipe;Ti tente oke akọkọ ba han laarin 80°C-90°C ati awọn oke giga ti o yatọ si han ni isalẹ 80°C, dimer alakoko ni a gbero ni ipilẹ.O le gbiyanju lati mu iwọn otutu annealing pọ si lati yanju rẹ;Ti tente oke akọkọ ba han laarin 80 ° C-90 ° C, ati pe oke oriṣiriṣi han lẹẹkansi nigbati iwọn otutu ba dide, o jẹ ipilẹ pe kontaminesonu DNA wa, ati pe DNA nilo lati yọkuro ni ipele ibẹrẹ ti idanwo naa.
Nitoribẹẹ, awọn ipo ajeji tun wa, eyiti yoo fọ ni ọkọọkan ni isalẹ.
3. Imọ to ti ni ilọsiwaju
Lati ṣe qPCR, Mo ni lati sọ MIQE,Alaye ti o kere julọfun AtẹjadePipoReal-akoko PCRAwọn idanwo — alaye ti o kere julọ fun titẹjade awọn nkan nipa gidi – akoko pipo PCRadanwo.Lati le rọrun oye gbogbo eniyan, a yoo ṣe irọrun akoonu bọtini.
O le wa ọrọ atilẹba ti MIQE lori Intanẹẹti, ati pe ohun pataki julọ ni pe o ṣalaye awọnakojọ ayẹwo data ti o nilo lati pese nigba titẹjade nkan kan .
Awọn oluyẹwo le ṣe idajọ didara idanwo naa nipa kika awọn alaye wọnyi;ojo iwaju onkawe si tun le lo eyi lati tun tabi mu awọn ṣàdánwò.
O tọ lati ṣe akiyesi pe ninu atokọ yii, pataki ti atokọ kọọkan ti samisi pẹlu E tabi D lẹsẹsẹ.Kini o je?E: alaye pataki (gbọdọ fi silẹ);D: alaye ti o fẹ (pese bi o ti ṣee ṣe).
MIQE (1) -Apẹrẹ idanwo
Ọpọlọpọ awọn scumbags ti o ti pari aabo wọn lẹhin ipari awọn ẹkọ ile-ẹkọ giga wọn kii yoo mọ bi wọn ṣe ṣe apẹrẹ idanwo ni ominira, ṣii awọn iwe ajako wọn, ati ṣe ohun ti olukọ sọ fun wọn lati ṣe.Nitoribẹẹ, apẹrẹ adanwo naa ko le, ati pe ẹka iṣatunṣe ti iwe irohin naa sọ pe wọn fẹ lati ṣe aworan yii ati aworan yẹn, nitorinaa wọn ṣe e ni ijaya.Báyìí ni wọ́n ṣe ń ṣe àwọn ẹ̀ṣẹ̀ náà!
Sunmọ si ile, ipilẹ akọkọ ti idanwo ni lati pinnuawọn rigor ti esiperimenta kannaa.Ohun pataki julọ ni apẹrẹ idanwo, ati pe ohun pataki julọ nipa apẹrẹ adanwo ni bii o ṣe le ṣeto apẹẹrẹ ibi-afẹde, apẹẹrẹ itọkasi (iṣakoso), ati nọmba awọn atunwi, ki data idanwo le jẹ itọkasi, afiwera, ati idaniloju.
Apeere afojusuntọka si ayẹwo ti o nilo ki a wa apilẹṣẹ ibi-afẹde lẹhin itọju kan.Apeere itọkasijẹ ayẹwo laisi eyikeyi itọju, eyiti a maa n tọka si bi iru egan ni isedale.
Awọn atunda esiperimentajẹ pataki pupọ.Ni gbogbogbo, nọmba awọn atunwi idaniloju gbọdọ jẹ diẹ sii ju mẹta lọ.O jẹ dandan lati ṣe iyatọ kini isọdọtun ti ibi ati kini ẹda imọ-ẹrọ.
Biological Replicates: Idanwo ijẹrisi kanna ti a ṣe pẹlu awọn ohun elo oriṣiriṣi (akoko, awọn ohun ọgbin, awọn ipele, awọn awo ifasẹ).
Ti ibi ẹda
Jẹ ki a mu itọju ipakokoropaeku ti ata gẹgẹbi apẹẹrẹ.A fẹ lati fun sokiri awọn ipakokoropaeku lori awọn irugbin mẹta ti ABC, lẹhinna awọn irugbin mẹta ti ABC jẹ awọn ẹda ti ẹda mẹta, ati pe wọn jẹ idanwo ijẹrisi kanna ti a ṣe pẹlu awọn ohun elo oriṣiriṣi.Ṣugbọn gẹgẹbi idanwo, o nilo iṣakoso ni pato, nitorinaa a le fun sokiri ọkan ninu awọn ẹka ti ọgbin A lati ṣe ẹgbẹ esiperimenta ti ọgbin A, kii ṣe fun sokiri awọn ẹka miiran ti ọgbin A lati ṣe ẹgbẹ iṣakoso kan.Ṣe kanna fun B ati C.
Awọn Atunse Imọ-ẹrọ (Awọn ẹda imọ-ẹrọ): O ti wa ni a tun ṣàdánwò še lati yago fun awọn aṣiṣe ṣẹlẹ nipasẹ isẹ, eyi ti o jẹ kosi kan àdáwòkọ iho to wa ni kanna awọn ohun elo ti.Awọn itọju mejeeji ati awọn idari gbọdọ ni awọn eto atunwi (o kere ju mẹta) ti jiini ibi-afẹde ati jiini itọkasi inu.
Imọ atunwi
Mu ata ti a tọju pẹlu awọn ipakokoropaeku bi apẹẹrẹ lẹẹkansi.Fun ẹgbẹ adanwo ti ọgbin A, a ṣe awọn iho PCR mẹta ti 1, 2, ati 3 fun jiini ibi-afẹde rẹ ati jiini itọkasi inu ni atele, ki o le mu aropin lẹhin wiwa.Fun iṣakoso ọgbin Awọn ẹgbẹ A tun ṣe itọju ni ọna kanna.Bakanna, ṣe itọju kanna fun awọn irugbin B ati C.Eyi jẹ atunwi imọ-ẹrọ.
O tọ lati ṣe akiyesi peohun ti o wọ inu awọn iṣiro jẹ atunwi ti ibi, ati atunwi imọ-ẹrọ ni lati ṣe idanwo boya eyikeyi awọn iyalẹnu laileto wa ninu ilana idanwo, lati jẹ ki awọn abajade esiperimenta jẹ igbẹkẹle, iyẹn ni, lati yago fun awọn aṣiṣe nipa gbigbe apapọ wọn bi a ti n sọ nigbagbogbo.
Awọn iṣakoso odi-NTC ati NRT
NTC (Iṣakoso Ko si Awoṣe), Iṣakoso laisi awoṣe, ni a lo lati rii daju boya ohun elo idanwo naa ti doti.Ni gbogbogbo, omi ti wa ni lilo bi awoṣe.Ti iṣesi Fuluorisenti kan ba wa, o tọka si pe kontaminesonu acid nucleic ti waye ninu yàrá.
Awọn idoti wọnyi wa lati: omi alaimọ, awọn reagents ti ko pe ti o ni DNA endogenous, idoti alakoko, idoti ohun elo yàrá yàrá, idoti aerosol, ati bẹbẹ lọ, nilo lati lo awọn scavengers RNase ati awọn inhibitors RNase.Idoti Aerosol jẹ eyiti o nira julọ lati wa.Fojuinu pe yàrá rẹ dabi smog, pẹlu ọpọlọpọ awọn acids nucleic ti daduro ni afẹfẹ.
NRT (Ti ko ni iyipada), Iṣakoso laisi iyipada iyipada, jẹ RNA ti kii ṣe iyipada bi iṣakoso odi, eyiti o jẹ iṣakoso ti iyoku gDNA.
Nigbati o ba n ṣe ikosile jiini, iye RNA ti wa ni wiwa nipasẹ wiwa iye cDNA lẹhin igbasilẹ yiyipada.Ti iyokù gDNA ba wa nigbati RNA ba di mimọ, yoo fa awọn aṣiṣe ninu awọn abajade esiperimenta, nitori awọn abajade gangan ti o gba jẹ gDNA ati cDNA.Ni ipele apapọ, kii ṣe cDNA nikan, gDNA nilo lati yọkuro patapata lakoko isediwon RNA.
MIQE (2) - alaye ayẹwo
Ohun ti a pe ni alaye ayẹwo tumọ si pe nigba ti a ba ṣe atẹjade nkan kan nipa qPCR, a gbọdọ ṣalaye alaye ayẹwo ni kedere, eyiti o jẹ apakan pataki ti nkan naa.Bakanna, nigba ti a ba ṣe ilana awọn ayẹwo, a tun gbọdọ ṣe ilana awọn iṣẹ tiwa lati rii daju pe awọn ayẹwo naa jẹ.
Apejuwe ti apẹẹrẹ jẹ abajade nikan, ati pe o yẹ ki a san diẹ sii si awọn ohun elo ti o mu lakoko gbogbo idanwo naa.
Asayan ti esiperimenta ohun elo
Awọn ayẹwo ẹjẹ - yan ẹjẹ titun, ko ju wakati mẹrin lọ.Awọn ayẹwo sẹẹli – yan lati gba awọn sẹẹli titun ni akoko idagbasoke ti o lagbara.Tissue Ẹranko—Yan titun, àsopọ ti n dagba ni agbara.Ohun ọgbin Tissue – Yan alabapade, odo àsopọ.
O gbọdọ ti ṣe akiyesi pe ọrọ pataki kan wa ninu awọn gbolohun ọrọ diẹ wọnyi: alabapade.
Fun awọn ayẹwo ti o wa loke, ohun elo ti o dara julọ, iye owo-doko, ati ohun elo iduroṣinṣin lori ọja jẹ ohun elo Foregene, eyiti o le yarayara ati irọrun yọ DNA ati RNA wọn jade.
Ohun ọgbin Total RNA ipinya Apo
Ohun ọgbin Total RNA ipinya Apo Plus
Ibi ipamọ ti awọn ohun elo idanwo
Ni gbogbogbo, a ko ṣeduro titoju awọn ayẹwo, ti awọn ipo ba gba laaye.Sibẹsibẹ, ọpọlọpọ awọn ọrẹ wa ti ko le ṣe awọn idanwo lẹsẹkẹsẹ lẹhin iṣapẹẹrẹ, ati diẹ ninu paapaa nilo lati gbe awọn tanki nitrogen olomi si aaye fun iṣapẹẹrẹ.
Fun iru ọrẹ ti n ṣiṣẹ takuntakun, Mo le sọ nikan pe o ko loye awọn ohun elo reagent.Bayi ọpọlọpọ awọn ile-iṣẹ ohun elo reagent gbejade awọn reagents ti o le fipamọ awọn ayẹwo RNA ni iwọn otutu yara, ati pe o le yan lati lo wọn.Ọna ibi ipamọ ti aṣa jẹ ibi ipamọ omi nitrogen, lilo omi kekere nitrogen ojò ti o rọrun lati gbe.Lẹhin ti o mu ayẹwo pada si yàrá-yàrá, tọju rẹ sinu firiji -80 ° C.
Fun awọn idanwo ti o kan RNA, ipilẹ ọrọ mẹfa gbọdọ tẹle:iwọn otutu kekere, ko si awọn enzymu,atisare .
Agbekale ti iwọn otutu kekere jẹ rọrun lati ni oye;laisi awọn enzymu, RNase wa nibi gbogbo ni agbaye ti a n gbe (bibẹẹkọ iwọ yoo ti pa nipasẹ HIV), nitorinaa bi o ṣe le yago fun RNase nigbati o ṣe awọn idanwo jẹ imọran pataki pupọ;yiyara,Ko si Kung Fu ni agbaye ti ko le fọ, iyara nikan ko le fọ.
Nitorinaa, ni ọna kan, akoko isediwon kukuru, ohun elo naa dara julọ.Kí nìdíForegene's kit rinlẹ iyara, nitori nwọn mọ o daradara.
PS: Diẹ ninu awọn ọmọbirin ṣe awọn idanwo ni pẹkipẹki, ṣugbọn wọn ko dara bi slam dunk lẹhin ọdun pupọ ti iṣẹ.Wọ́n nímọ̀lára pé Ọlọ́run jẹ́ aláìṣòdodo, ó ń ṣàròyé nípa àwọn ẹlòmíràn, ó sì ń wá ìwàláàyè.Kódà, kò lóye rẹ̀.Ko ṣe aabo fun RNA daradara, ati ẹrọ orin slam dunk jẹ nimble.Nigbati o n ṣe idanwo naa, o ro pe oun yoo pari slam dunk pẹlu igba mẹta, igba marun ati awọn pipin meji, ṣugbọn o ṣe idanwo naa daradara.
Akiyesi: Losokepupo, diẹ Iseese ti RNase ayabo.Bawo ni lati kọ ara rẹ lati yara?Ko si ọna, kan ṣe adaṣe diẹ sii.
Fun awọn idanwo oriṣiriṣi ati awọn apẹẹrẹ oriṣiriṣi, o tun jẹ dandan lati ka awọn iwe diẹ sii ati yan ọna ti o yẹ fun sisẹ.Fun ikojọpọ ayẹwo ati ilana ipamọ, MIQE nilo pe o gbọdọ kọ ni kedere ninu iwe naa, ki awọn oluyẹwo le ṣe atunyẹwo igbẹkẹle ti iwe naa, ati pe o tun rọrun fun awọn ọdọ ti o daamu lati tun ṣe idanwo rẹ.
Bó tilẹ jẹ pé ti ibi adanwo ni o wa soro, won ni o wa ga-opin.Ti o ko ba ṣọra, o le yi aye pada.Fun apẹẹrẹ, ṣiṣe SARS sinu idaamu biokemika kan, tabi ṣiṣe iresi arabara lati ṣafipamọ awọn eniyan bilionu 1.3.Aworan ti o wa ni isalẹ jẹ idanwo kemikali, o yẹ ki o loye bi o ṣe gberaga ti iwadii rẹ nikan nipa wiwo irisi dick rẹ.Gbagbe, ma ṣe dudu fun u.
MIQE (3) - isediwon acid nucleic.
Iyọkuro acid Nucleic jẹ iṣẹlẹ nla, ati gbogbo awọn adanwo isedale molikula bẹrẹ pẹlu isediwon acid nucleic.Ni akọkọ, jẹ ki a daakọ akoonu MIQE lori isediwon acid nucleic.
Wiwo fọọmu yi, o ko le duro lori dada.Fọọmu naa jẹ dogma kan.Lati jẹ ọmọ ile-iwe giga, o gbọdọ beere idi.Awọn ibaraẹnisọrọ akoonu ti yi tabili ni: Lepamimọ, iyege, aitasera, ati iye isediwon ti RNA .
Ni igba akọkọ ti apa ti awọnilana tabi ohun elo jẹ igbesẹ isediwon acid nucleic.Ti o ba lo olutọpa acid nucleic laifọwọyi lati jade (ilọsiwaju, jọwọ kan si mi fun rira), o nilo lati tọka orukọ awoṣe ti ohun elo naa.
Awọn orukọ ti awọn kit ati
kini ohun elo ti a lo fun awọn alaye iyipada, kini awọn atunto pataki ti a ṣafikun tabi kini awọn iṣẹ pataki ti a ṣe yẹ ki o ṣalaye ni kedere ki awọn miiran le ni irọrun tun ṣe idanwo rẹ.
Diẹ ninu awọn eniyan ṣafikun diẹ ninu awọn reagents pataki nigba yiyo awọn ayẹwo pataki, ni ero pe eyi ni ohun ija aṣiri wọn ati pe ko sọ fun awọn miiran.Lakoko ti o tọju rẹ ni aṣiri, wọn tun padanu aye lati jẹ ki nkan rẹ tàn.Maṣe jẹ onilàkaye, o ni lati jẹ oloootitọ ju orilẹ-ede atijọ Zhang lọ ni iwadii imọ-jinlẹ, ti o ba fẹ jẹ ọlọgbọn, nkan naa yoo sọ ọ di aṣiwere.
gbọdọ ranti awọn ọja nọmba ti awọn kitnigbati o ba paṣẹ ohun elo ati kọ nkan naa.Awọn nọmba meji ni gbogbogbo wa lori ohun elo naa: Cat—nọmba katalogi (nọmba ọja, nọmba nkan), Lọọti — nọmba pupọ ọja (Ti a lo lati tọka iru ipele ti ọja naa wa).
Ni afikun, nọmba CAS nigbagbogbo lo nigbati o ba n paṣẹ awọn reagents biokemika, ati pe Emi yoo sọ di olokiki papọ.Nọmba CAS jẹ nọmba ti Awujọ Kemikali Amẹrika ti fun si oogun kẹmika tuntun kọọkan.Ni gbogbogbo, awọn nọmba mẹta ni asopọ nipasẹ daaṣi kan.Rushui ká CAS nọmba: 7732-18-5.Awọn kemikali nigbagbogbo ni ọpọlọpọ awọn inagijẹ, ṣugbọn nọmba CAS jẹ alailẹgbẹ.Nigbati o ba nbere oogun, o le ṣayẹwo nọmba CAS rẹ ni akọkọ.
Sunmọ ile, kilode ti a ni lati ṣe apejuwe nkan wọnyi ni kedere?Ni otitọ, o tun jẹ lati ṣayẹwo didara isediwon RNA.Lilo awọn ohun elo ati awọn ohun elo yoo jẹ ki isediwon RNA jẹ ibamu diẹ sii.Iwọn isediwon ti awọn ile-iṣere lasan ko tobi, ati pe o le gba pẹlu awọn ohun elo.
Awọn alaye ti DNAse tabi RNase itọju
Ọrọ pataki ti PCR pipo fluorescent ni lati yago fun idoti DNA, ati pe ma ṣe ṣe idanwo ti ibajẹ ba wa.Nitorina, o jẹ dandan lati sọ ilana ti o lo lati ṣe ilana DNA, lati le ṣe afihan pe DNA ti o wa ninu ilana idanwo ti jẹ patapata ati patapata kuro.ni ipoduduro nipasẹ a sikematiki aworan atọka.
Aworan atọka ti RNA ati DNA
Ni gbogbogbo, ọna fun yiyọ DNA ni lati tọju RNA pẹlu DNA lẹhin isediwon.Sibẹsibẹ, iwọnyi jẹ awọn ọna atijọ.Awọn ohun elo isediwon RNA ti iṣowo ti ni anfani lati yọ DNA kuro lakoko ilana isediwon laisi fifi DNAse kun.Fun apẹẹrẹ, lẹsẹsẹ awọn ohun elo lati Foregene.
Akiyesi: Yiyọ DNA kuro lakoko isediwon RNA jẹ idamu oloju meji ti o lewu pupọ, eyiti yoo fa akoko iṣẹ ṣiṣe ti isediwon RNA pọ si ati mu eewu ibajẹ RNA pọ si.Ni ipilẹ, o jẹ iṣowo-pipa laarin ikore RNA ati mimọ.
Ni afikun, iye DNase ti a fi kun si ọwọn adsorption orisun silica jẹ kekere pupọ, ati pe DNase ti o ga julọ gbọdọ ṣee lo lati ṣaṣeyọri ipa naa.DNase ti ko ni iṣapeye ko le jẹ digested ni kiakia ati patapata.Eyi jẹ idanwo ti ipele imọ-ẹrọ ti oniṣowo.Nitoribẹẹ, awọn oniṣowo ajeji paapaa wa ti o ṣogo pe DNA le yọkuro laisi DNAse.A le sọ pe ẹnikẹni ti o ba nṣogo pe DNA le yọkuro patapata laisi DNA jẹ hooligan.DNA jẹ ẹya iduroṣinṣin to ni ilopo meji, ati pe ko le parẹ kuro nipa sisọ ati rẹrin nikan.
Ayẹwo koto
ọna igbelewọn: wiwa electrophoresis, 1% agarose, 6V/cm, 15min, ikojọpọ 1-3 ul
Nucleic acid pipo onínọmbà
maa n wọn nipa lilo spectrophotometer UV.Jẹ ki n kọkọ gbaki itumọ ti awọn iye mẹta ti OD260, OD280, ati OD230.
· OD260nm: O jẹ iwọn gigun gbigba ti oke gbigba ti o ga julọ ti acid nucleic, ati pe iye iwọn to dara julọ lati 0.1 si 1.0.Ti kii ba ṣe bẹ, dilute tabi ṣojumọ ayẹwo lati mu wa laarin iwọn.
· OD280nm: O jẹ iwọn gigun gbigba ti oke gbigba gbigba ti o ga julọ ti amuaradagba ati awọn nkan phenolic.
· OD230nm: O jẹ iwọn gigun gbigba ti oke gbigba gbigba ti o ga julọ ti awọn carbohydrates.
Nigbamii, jẹ ki a sọrọ nipa ipa ti atọka kọọkan.Fun A260, o le ṣee lo lati wiwọn ikore ti nucleic acid.Nigbati OD260=1, dsDNA=50μg/ml, ssDNA=37μg/ml, RNA=40μg/ml.
Fun mimọ, a nilo lati wo awọn ipin ti a rii ni igbagbogbo: OD260/280 ati OD260/230.
· DNA mimọ: OD260/280 jẹ isunmọ dogba si 1.8.Nigbati o ba tobi ju 1.9, o tọka si pe idoti RNA wa, ati nigbati o kere ju 1.6, o tọka si pe amuaradagba ati idoti phenol wa.
· RNA mimọ: 1.7
· OD260/230: Boya o jẹ DNA tabi RNA, awọn itọkasi iye 2,5.Nigbati o ba kere ju 2.0, o tọka si pe idoti gaari, iyo ati ohun elo Organic wa.
RNA iyege
O ṣe pataki pupọ lati wiwọn iyege ti RNA.Ni gbogbogbo, o jẹ dandan lati ṣe idanwo gel denaturation RNA lati ṣayẹwo boya imọlẹ laarin 28S ati 18S RNA jẹ ibatan ilọpo meji.Nigbati ẹgbẹ kẹta 5S ba han, o tumọ si pe RNA ti bẹrẹ lati dinku, ayafi awọn invertebrates.
Awọn data fun igbelewọn didara RNA: Ni afikun si awọn idanwo ti o wa loke, awọn idanwo irinse ilọsiwaju diẹ sii tun wa ni awọn ofin ti iduroṣinṣin RNA, gẹgẹ bi idanwo iduroṣinṣin RQI ti eto itanna eletiriki adaṣe, eyiti o le rii boya RNA ti bajẹ lairi.
Ninu iwadii imọ-jinlẹ, PCR pipo fluorescent jẹ afiwera laarin jiini ibi-afẹde ati jiini itọkasi inu.Nitorinaa, ninu ilana ti itọju ayẹwo RNA, isediwon RNA, ati bẹbẹ lọ, ibi-afẹde akọkọ ni lati rii daju pe iduroṣinṣin ti RNA.
Bii iduroṣinṣin ti RNA ṣe ni ipa lori iwọntunwọnsi laarin jiini ibi-afẹde ati jiini itọkasi inu le ni irọrun loye lati nọmba ti o wa ni isalẹ.Ibajẹ yoo yorisi ailagbara pupọ, boya o jẹ aipe ti apilẹṣẹ itọkasi inu tabi aipe ti jiini ibi-afẹde, yoo ni ipa nla lori data naa.
Aworan atọka ti jiini ibi-afẹde ati jiini itọkasi, ko gbọdọ jẹ otitọ
Idanwo idinamọ (boya iye CT ti dinku labẹ ifọkansi giga tabi kekere tabi awọn ipo miiran)
Gbigba eeya yii gẹgẹbi apẹẹrẹ, awọn iye Ct ti awọn igun marun jẹ bi atẹle.Pipin awọn iye CT laarin awọn iṣipopada ko ni deede, ati pe awọn iye Ct ni idaduro labẹ awọn ifọkansi giga ati kekere, eyiti o jẹ ọran ti idinamọ PCR.
Koko bọtini: Ninu ilana isediwon RNA, a nilo lati kọ awọn aburu ati fi idi eyi mulẹ.
Ero ti ko tọ ni: isediwon RNA nikan lepa ikore, ni ero pe iye RNA ti o tobi julọ ti o gba, dara julọ.Ni otitọ, nigba ti a ba ṣe titobi, ti nọmba awọn jiini ko ba tobi pupọ, a ko nilo RNA pupọ.Iye RNA ti o jade jẹ diẹ sii ju to.
Ilana ti o pe ni:Iyọkuro RNA yẹ ki o lepa mimọ, iduroṣinṣin ati aitasera.Mimo le rii daju pe transcription ti o tẹle ti ko ni idinamọ ati pe data ko ni ni ipa nipasẹ DNA.Iduroṣinṣin ṣe idaniloju iwọntunwọnsi ti awọn ilana ibi-afẹde ati awọn itọkasi inu.Iduroṣinṣin ṣe idaniloju ikojọpọ apẹẹrẹ iduroṣinṣin.
MIQE (4) - yiyipada transcription
Èrò òdì: ifojusi iwọn iwọn ayẹwo ti o ga julọ.
Erongba ti o tọ: Lepa aitasera (iduroṣinṣin), laibikita iye RNA ti kojọpọ, ṣiṣe ti transcription yiyipada si maa wa ni ibamu, ni idaniloju pe awọn iyatọ ninu cDNA le ṣe afihan awọn iyatọ nitootọ ni mRNA.
A ṣe alaye ilana yii pẹlu aworan atọka kan:
Aworan atọka ti iṣiṣẹ transcription yiyipada, maṣe jẹ otitọ
Ni akọkọ, a nilo lati ni oye iyatọ laarin ilana iyipada iyipada ati ilana PCR.PCR faragba ọpọ alapapo ati annealing lakọkọ, ati awọn afojusun ajeku gbooro exponentially;lakoko ti iṣipopada iyipada ko ni ilana yii, a le fojuinu pe iyipada iyipada jẹ gangan ọkan-si-ọkan Lakoko ilana isọdọtun, bii ọpọlọpọ awọn ege RNA
bi o ti le gba bi ọpọlọpọ awọn ege Alaye cDNA, o yẹ ki o loye ni bayi, nitori awọn ajẹkù nla ati kekere ti ni iyipada-igbasilẹ, ati pe ko ṣee ṣe lati dojukọ ajẹkù kan.Ati nitori pe iye RNA jẹ kekere, iye cDNA ti o gba tun jẹ kekere, ko dabi PCR, eyiti o ni ipa imudara, nitorinaa ko ṣee ṣe lati rii.
Awọn abajade electrophoresis cDNA
Ni ẹẹkeji, ni apere, ifasilẹ iyipada jẹ ṣiṣe ọkan-si-ọkan, ṣugbọn ko si iwe-kikọ yiyipada lati ile-iṣẹ eyikeyi ti o le ṣaṣeyọri ipa yii.Ni ipilẹ, ṣiṣe ti ọpọlọpọ awọn iwe-kikọ yiyipada ti n rin kiri laarin 30-50%.Ti eyi ba jẹ ọran naa, a yoo kuku ni iṣẹ ṣiṣe transcription iduroṣinṣin ti o ni ibatan, eyiti o jẹ ohun ti a fẹ lati rii ninu eeya naa: 3 RNA gba awọn cDNAs 2, awọn RNA 6 gba awọn cDNA 4, nitorinaa bii iye ti a kojọpọ ti apẹẹrẹ, ṣiṣe ṣiṣe transcription yiyipada jẹ iduroṣinṣin to.A ko fẹ lati rii ipo nibiti iṣẹ ṣiṣe transcription yiyipada jẹ riru ati ifọkansi giga ti ni idinamọ.
Nitorinaa, bawo ni a ṣe le rii daju boya iṣẹ ṣiṣe transcription yiyipada jẹ iduroṣinṣin?Ọna naa rọrun pupọ, o nilo lati ṣe idanwo lafiwe nikan: ọkan ni lati yiyipada atunkọ sinu cDNA lẹhin ilọpo meji ti RNA, ati ekeji ni lati ṣe dilution ilọpo meji lẹhin iyipada transcribing sinu cDNA, ati lẹhinna ṣe qPCR lati rii ite ti o gba Ṣe o ni ibamu.Gẹgẹbi ọmọ ile-iwe giga, o yẹ ki o loye rẹ ni iṣẹju-aaya.Bi o ṣe han ni isalẹ:
Dilution ti RNA ati cDNA lati ṣe idanwo boya ṣiṣe ti transcription yiyipada jẹ iduroṣinṣin
Yiyipada transcriptase ati kit
Bawo ni pipo Fuluorisenti pipe PCR ṣe le ni iyipada ti o tayọ ati ohun elo.Iyipada transcriptase ti pin aijọju si awọn oriṣi meji ni ibamu si orisun, AMV tabiM-MLV, ati awọn iṣẹ wọn jẹ kanna bi ti o han ninu tabili.
RNase H aṣayan iṣẹ-ṣiṣe
RNase H jẹ Ribonuclease H, orukọ Kannada jẹ ribonuclease H, eyiti o jẹ endoribonuclease ti o le ṣe hydrolyze RNA ni pataki ni pq arabara DNA-RNA.RNase H ko le ṣe hydrolyze awọn iwe phosphodiester ni okun-ẹyọkan tabi DNA tabi RNA ti o ni ilọpo meji, iyẹn ni, ko le di oni-okun kan tabi DNA oni-meji tabi RNA.Wọpọ ti a lo ninu iṣelọpọ ti okun keji ti cDNA.
Ohun ajeji ni.A sọ pe iyipada transcriptase ni iṣẹ RNase H, kii ṣe pe iyipada transcriptase ni RNase H ni, ati pe o le ma ṣee ṣe lati ya RNase H kuro ni yiyipada transcriptase, boya nitori imudara awọn ẹgbẹ kan ni yiyipada transcriptase Iṣe yii jẹ idi nipasẹ ifasilẹ transcriptase.
Nitorinaa, laibikita iṣẹ ṣiṣe transcription ti o ga julọ ti AMV, iṣẹ RNase H rẹ dinku ikore ti cDNA.Nitoribẹẹ, awọn aṣelọpọ reagent nigbagbogbo n mu awọn ọja wọn pọ si lati yọkuro iṣẹ ṣiṣe RNase H ni iyipada transcriptase bi o ti ṣee ṣe lati mu ikore ti cDNA pọ si.
Annealing otutu
Eto keji ti RNA ni awọn iwọn otutu oriṣiriṣi
Wo eeya ti o wa loke fun eto ile-atẹle ti RNA ni awọn iwọn otutu oriṣiriṣi, ati lo ohun elo ori ayelujara mFold lati pinnu eto atẹle ti ajeku ibi-afẹde labẹ iwọn otutu kan pato ati awọn ipo ifọkansi iyọ.Ni 55°C, eto-atẹle ti RNA tun jẹ idiju pupọ, yiyipada transcriptase ko le ṣiṣẹ, ati pe eto atẹle ko le ṣe ipinnu patapata titi di 65°C, lakoko ti iwọn otutu to dara julọ ti AMV ati M-MLV kere ju iwọn otutu yii lọ.
kin ki nse?Eto ile-ẹkọ keji jẹ isọdọkan ibaramu ti awoṣe funrararẹ, eyiti o yori si idije to lagbara laarin alakoko ati yiyipada transcriptase ati awoṣe, ti o mu abajade awọn iṣoro lọpọlọpọ bii E kekere ati aṣetunṣe ti ko dara.
kin ki nse?Mu iwọn otutu annealing pọ si bi o ti ṣee ṣe.
Ọpọlọpọ awọn olupilẹṣẹ reagent n ṣe ilọsiwaju itọpa iwe-kikọ wọn nipasẹ imọ-ẹrọ jiini.Diẹ ninu awọn iwọn otutu ti ifaseyin pọ si, gẹgẹbi Jifan ati Aidelai, ati diẹ ninu awọn yọ ẹgbẹ ti nṣiṣe lọwọ ti henensiamu RNase H lati mu ilọsiwaju laarin henensiamu ati awoṣe RNA.Ibaṣepọ giga le ni idije fun pọ jade eto ile-ẹkọ keji ki o ka nipasẹ laisiyonu, ati pe o tun mu imunadoko yiyipada pọ si.
Koko bọtini: Iyipada iyipada jẹ pataki diẹ sii lati lepa aitasera ti iṣiṣẹ transcription yiyipada (awọn enzymu ko gbọdọ jẹ daradara nikan ṣugbọn tun jẹ iduroṣinṣin), dipo iye ayẹwo ti a kojọpọ, ti kii ba jẹ PCR pipo fluorescent pipọ, kii yoo ṣee ṣe rara.Awọn cDNA lọpọlọpọ.
Orisirisi awọn olupese ti tun ṣe diẹ ninu awọn akitiyan ninu awọn ilepa ti aitasera.Fun apẹẹrẹ, ọpọlọpọ awọn ile-iṣẹ ni bayi ti ṣajọ transcription yiyipada bi ohun elo boṣewa fun tita, eyiti o jẹ yiyan ti o dara.
Fun apẹẹrẹ, awọn ohun elo RT Easy Series Foregene:
RT Rọrun I (Premix Titunto fun ohun elo iṣelọpọ cDNA okun akọkọ)
MIQE (5) - alaye jiini afojusun
Nọmba ti o wa loke salaye
1. Boya jiini yii jẹ doko fun awọn idanwo ti o leralera le jẹri ni gbogbogbo nipasẹ awọn adanwo leralera.
2. Gene ID, o mọ.
3. Gigun Gene, ipari lapapọ ti jiini afojusun jẹ pato ko si iṣoro.Nigbati o ba n ṣe apẹrẹ awọn alakoko, rii daju pe ipari ti amplicon wa laarin 80-200bp lati rii daju ṣiṣe imudara to dara julọ.
4. Alaye lafiwe Blast lẹsẹsẹ, Jiini ibi-afẹde nilo lati ṣe afiwe ni banki genebank lati ṣe idiwọ imudara ti kii ṣe pato.
5. Iwaju ti pseudogenes.Pseudogene jẹ ilana DNA ti o jọra si jiini deede ṣugbọn o padanu iṣẹ deede rẹ.Nigbagbogbo o wa ninu idile pupọ-jiini ti eukaryotes.Nigbagbogbo o jẹ aṣoju nipasẹ ψ.O jẹ ẹda DNA jinomiki ti kii ṣe iṣẹ ni jiini ti o jọra pupọ si ilana jiini ifaminsi., ti wa ni gbogbo ko transcrited, ati ki o ni ko si ko o ẹkọ ẹkọ ẹya-ara itumo.
6. Ipo ti awọn alakoko ojulumo si exons ati introns.Ni awọn ọdun ibẹrẹ, nigba ti a yanju iṣoro ti ibajẹ DNA, a nigbagbogbo san ifojusi si awọn ipo ti awọn alakoko, exons, ati awọn introns, ati ni gbogbo igba ti a pinnu lati ṣe apẹrẹ awọn alakoko kọja awọn introns lati yago fun imudara DNA.Jọwọ wo nọmba ti o wa ni isalẹ: dudu duro fun introns, ọpọlọpọ awọn blues duro fun exons, Pink duro fun awọn alakoko ti o wọpọ, ati pupa didan duro fun awọn alakoko intron-spanning.
Sikematiki, kii ṣe otitọ
Kini ero pipe ti eyi dabi, ṣugbọn ni otitọ, ni ọpọlọpọ igba, awọn alakoko trans-intron kii ṣe idan bi a ti ro, ati pe wọn yoo tun fa imudara ti kii ṣe pato.Nitorinaa ọna ti o dara julọ lati ṣe idiwọ ibajẹ DNA ni lati yọ DNA kuro patapata.
7. Asọtẹlẹ conformation.Lilo apẹẹrẹ yii lẹẹkansi, lo ohun elo ori ayelujara mFold lati pinnu eto keji ti ajeku ibi-afẹde ni iwọn otutu kan pato ati ifọkansi iyọ.
Eto keji ti RNA ni awọn iwọn otutu oriṣiriṣi
Eto Atẹle jẹ isọdọkan ibaramu ti awoṣe funrararẹ, eyiti yoo ja si idije to lagbara laarin alakoko ati sisopọ awoṣe, ati awọn aye ti abuda alakoko ko dinku, ti o mu abajade awọn iṣoro lọpọlọpọ bii E kekere ati aiṣe atunṣe ti ko dara.Nipasẹ asọtẹlẹ sọfitiwia, ti ko ba si iṣoro igbekalẹ keji, iyẹn yoo jẹ nla.Ti o ba wa, nkan ti o tẹle wa yoo jiroro ni pataki bi a ṣe le yanju iṣoro yii.
MIQE (6) -qPCR Oligonucleotides
Fun PCR pipo fluorescent, ohun akọkọ ti o tiraka pẹlu gbogbo ọjọ ni isediwon RNA, ati ohun keji le jẹ apẹrẹ alakoko.
Ni akọkọ, a tun ṣayẹwo awọn ofin nipa apẹrẹ alakoko ni ibamu si atokọ ayẹwo MIQE.O rọrun pupọ pe awọn scumbags le rẹrin, ati pe a le pari rẹ ni gbolohun kan: wa ọkọọkan ati ipo ti iwadii alakoko ati ọna iyipada.Fun ọna isọdọtun alakoko, iṣelọpọ alakoko jẹ olowo poku ni lọwọlọwọ, qPCR yẹ fun PAGE ati awọn ọna iwẹnumọ loke, ati alaye ti ohun elo iṣelọpọ ko ṣe pataki.Ọpọlọpọ eniyan ti n ṣe awọn alakoko fun awọn ewadun ati pe wọn ko mọ pe synthesizer jẹ ABI3900.
Nipa awọn ilana ti apẹrẹ alakoko, iwọ ko ni lati ṣe akori wọn nipasẹ rote, nitori ọpọlọpọ sọfitiwia apẹrẹ alakoko tabi awọn irinṣẹ ori ayelujara le ṣe abojuto awọn iṣoro wọnyi (iṣayanju ọpa ori ayelujara primer3.ut.ee/), ati 99.999% ti apẹrẹ alakoko ko ṣe pẹlu ọwọ Wo, onkọwe nigbakan ṣe apẹrẹ awọn ọgọọgọrun awọn alakoko ni ọjọ kan, ti o ba ka ọkan nipasẹ ọkan, yoo di.
Kan ṣayẹwo awọn aaye wọnyi lẹhin ti a ṣe apẹrẹ awọn alakoko:
1. Awọn alakoko apẹrẹ ti o sunmọ opin 3 ': Ninu ọran ti lilo awọn alakoko oligo dT fun cDNA akọkọ-strand synthesis, ti o ṣe akiyesi iṣiṣẹ transcription yiyipada ati iduroṣinṣin RNA, awọn alakoko ti a ṣe apẹrẹ nilo lati ṣe apẹrẹ ti o sunmọ opin 3′ lati mu ilọsiwaju imudara pọ si.Lo aworan kan lati ṣalaye bi atẹle (ko si ọna lati loye eyi):
Kini idi ti o yẹ ki a ṣe apẹrẹ awọn alakoko sunmọ opin 3′, ko gbọdọ jẹ otitọ
2. Iye TM: Iwọn Tm wa ni 55-65 ° C (nitori pe iṣẹ exonuclease jẹ ga julọ ni 60 ° C), ati akoonu GC wa ni 40% -60%.
3. BLAST: Ni ibere lati yago fun amúṣantóbi ti aisi-pato ti jiomeji, Blast gbọdọ wa ni lo fun afikun ijerisi.
MIQE (7) -qPCR ilana
1. qPCR ohun elo
Ni ibamu si awọn ibeere ti MIQE, a gbọdọ ṣe apejuwe ni kedere awọn ipo ifasẹyin pipe ninu nkan naa, pẹlu iṣeto ni ti eto ifaseyin PCR, ohun elo wo ni a lo, tani o jẹ olupese, bawo ni eto ifa ṣe tobi, boya ọna dai tabi ọna iwadii ti lo, awọn eto eto PCR.Awọn awakọ oniwosan yoo rii daju pe niwọn igba ti a ti yan ohun elo naa, alaye ti o wa loke ti pinnu ni ipilẹ.
Lọwọlọwọ, iṣelọpọ ati iṣelọpọ ti awọn ohun elo PCR pipo fluorescent jẹ imọ-ẹrọ ti o dagba pupọ.Niwọn igba ti o ko ba yan awọn aṣelọpọ buburu pupọ, iṣeeṣe ti awọn iṣoro ko ga, ṣugbọn a tun fẹ lati pin pẹlu rẹ awọn aaye diẹ:
Ibẹrẹ Taq Enzymu:Apakan pataki julọ ti PCR ni itanna Taq ti o gbona.Awọn ensaemusi ibẹrẹ ti o gbona lori ọja ni gbogbogbo pin si awọn oriṣi meji, ọkan jẹ enzymu ibẹrẹ-ibẹrẹ ti kemikali ti a yipada (o le fojuinu rẹ bi ifibọ paraffin), ati ekeji jẹ enzymu ti o gbona-ibẹrẹ fun iyipada antibody (asopọ antigen-antibody).Iyipada kemikali jẹ ọna kutukutu ti awọn enzymu ti o bẹrẹ gbona.Nigbati iwọn otutu kan ba de, enzymu yoo tu iṣẹ ṣiṣe rẹ silẹ.Enzymu ibẹrẹ-gbigbona ti a ṣe atunṣe antibody nlo awọn ọna ti ibi lati dènà iṣẹ ṣiṣe ti henensiamu naa.Nigbati iwọn otutu kan ba ti de, agboguntaisan yoo jẹ denatured ati aiṣiṣẹ bi amuaradagba, ati pe iṣẹ ṣiṣe henensiamu yoo wa sinu ere.
Sibẹsibẹ, kini iwulo eyi?Eyi ni ọran naa, iṣẹ itusilẹ ti awọn enzymu antibody ti a yipada yiyara ju ti awọn ensaemusi ti a ṣe atunṣe kemikali, nitorinaa ni awọn ofin ti ifamọ, awọn enzymu antibody ti a yipada ni anfani diẹ, nitorinaa ni ipilẹ ko si awọn enzymu kemikali ti a yipada ni awọn ohun elo lori ọja naa.Ti o ba wa, lẹhinna imọ-ẹrọ olupese yii tun di ni akoko ti egberun ọdun.
Iṣọkan iṣuu magnẹsia:Idojukọ iṣuu magnẹsia jẹ pataki pupọ ninu iṣesi PCR.Idojukọ ion iṣuu magnẹsia ti o yẹ le ṣe igbelaruge itusilẹ ti iṣẹ ṣiṣe enzyme Taq.Ti ifọkansi ba kere ju, iṣẹ-ṣiṣe henensiamu yoo dinku ni pataki;ti ifọkansi ba ga ju, imudara ti kii ṣe pato ti enzymu-catalyzed yoo ni ilọsiwaju.Ifojusi ti awọn ions iṣuu magnẹsia yoo tun ni ipa lori annealing ti awọn alakoko, iwọn otutu yo ti awoṣe ati awọn ọja PCR, nitorinaa ni ipa lori ikore ti awọn ajẹkù ti o pọ si.Ifojusi ti awọn ions magnẹsia ni gbogbogbo ni iṣakoso ni 25mM.Nitoribẹẹ, fun ohun elo to dara, ifọkansi ti awọn ions magnẹsia gbọdọ wa ni iṣakoso daradara.Diẹ ninu awọn oniṣowo ṣafikun aṣoju iṣuu magnẹsia ion chelating si reagent, eyiti o le ṣaṣeyọri ipa ti iṣatunṣe aifọwọyi ti ifọkansi ion iṣuu magnẹsia.
Ifojusi awọ Fuluorisenti:Awọ Fuluorisenti, eyiti o jẹ SYBR Green ti a maa n lo, ni akọkọ n ṣe itanna nipa didara si aaye kekere ti DNA ti o ni ilọpo meji, nitori asopọ ti dai si DNA ti o ni okun meji kii ṣe pato, iyẹn ni lati sọ Niwọn igba ti DNA ti o ni ilopo meji ti wa ni idapo pẹlu rẹ, fluorescence awoṣe le šẹlẹ ni eto ati ipilẹṣẹ DNA.
PS: Nitori awọn ohun-ini ifaramọ ina rẹ, awọn ọja ti o wa lori ọja ni a ṣajọpọ ni gbogbogbo ni awọn tubes centrifuge opaque brown (bii o han ninu aworan ni isalẹ).Sibẹsibẹ, eyi yoo koju iṣoro kan.O soro lati rii boya omi ti fa mu nigba iṣapẹẹrẹ.Ni ọwọ yii, nitootọ Qingke jẹ ore-olumulo julọ (gẹgẹ bi o ṣe han ninu aworan ni isalẹ), ati pe tube ti o han gbangba jẹ akopọ ninu apo tin akomo.Lẹhinna fi sii sinu apo idẹ kan, ni akiyesi irọrun ti yago fun ina ati iṣapẹẹrẹ.O gbọdọ yan nọmba ọja to tọ.TSE204 ni a Super iye owo-doko aye, eyi ti o mu mi fẹ lati gbin koriko.
Ifojusi ti awọ Fuluorisenti tun jẹ pataki pupọ.Ti ifọkansi ba kere ju, iṣipopada ampilifaya kii yoo lọ soke ni ipele nigbamii ati pe ko pe;ti ifọkansi ba ga ju, yoo fa kikọlu ariwo.Niwọn bi PCR pipo fluorescent ni akọkọ da lori iye CT, ti ifọkansi ti awọ Fuluorisenti ko ba ni atunṣe daradara, aaye kekere dara ju aaye giga lọ.Nitoribẹẹ, ifọkansi awọ ti o yẹ ni o dara julọ.
ROX: Awọn awọ ROX ni a lo lati ṣe atunṣe fun awọn aṣiṣe ifihan agbara fluorescence daradara-si-daradara.Diẹ ninu awọn aṣelọpọ ohun elo nilo isọdiwọn, lakoko ti awọn miiran ko ṣe.Fun apẹẹrẹ, lilo Thermo Fisher Scientific's Real Time PCR amplification irinse nigbagbogbo nilo isọdiwọn, pẹlu 7300, 7500, 7500Fast, StepOnePlus, ati bẹbẹ lọ Awọn ilana kit gbogbogbo yoo ṣe apejuwe rẹ.
Foregene's qPCR Mix tun ni ROX dye, eyiti o rọrun fun lilo ni awọn awoṣe lọpọlọpọ.
Ailagbara hydrogen mnu itọju: Itọju awọn ifunmọ hydrogen alailagbara jẹ ọrọ imọ-ẹrọ ti o jo.Ko si ohun ti o ti ka awọn itọnisọna ti ọpọlọpọ awọn ohun elo, ṣugbọn ko si ọkan ninu wọn ti o mẹnuba koko yii.Ni otitọ, o ṣe pataki pupọ.Apapo ti awọn ipilẹ ni pataki da lori agbara awọn ifunmọ hydrogen.Awọn ifunmọ hydrogen ti o lagbara jẹ imudara deede, ati awọn ifunmọ hydrogen alailagbara yori si imudara ti kii ṣe pato.Ti awọn ifunmọ hydrogen alailagbara ko ba le yọkuro daradara, imudara ti kii ṣe pato ko le yago fun.Laarin ipari ti onkọwe, awọn ile-iṣẹ diẹ nikan ti ṣe akiyesi iṣoro yii.Nigbati o ba ra ohun elo naa, o le tọka si boya o ti gbero ojutu kan ni iyi yii fun ohun elo ti o fẹ yan.
iwọn didun lenu: Eto 20-50ul ti wa ni lilo diẹ sii, ati awọn ipele ti o kere julọ le fa awọn aṣiṣe.Ni gbogbogbo, awọn itọnisọna kit yoo ṣeduro lilo awọn iwọn ifa PCR.Maṣe jẹ ọlọgbọn ati lo awọn iwọn kekere lati ṣafipamọ awọn idiyele.awọn ìlépa ti.Iwọn ti a ṣe iṣeduro nipasẹ awọn oniṣowo ti ni idanwo gangan, ati pe o le jẹ pe wọn ko le yanju iṣoro ti awọn aṣiṣe ti o fa nipasẹ awọn iwọn kekere.
2. Olupese ati nọmba article ti tube awo
Gbogbo eniyan mọ ilana ti PCR pipo Fuluorisenti.Gbigba Fuluorescence ni a ṣe ni pataki nipasẹ awọn bọtini tube PCR.Nigbati o ba yan awọn ohun elo PCR, san ifojusi si awọn aaye meji: gbigbe ina to dara ati pe o dara fun ohun elo naa.Ni gbogbogbo, awọn igbimọ ati awọn tubes ti awọn ami iyasọtọ jẹ itanran, ṣugbọn o ni lati yan ni pẹkipẹki ni awọn ofin ti aṣamubadọgba, bibẹẹkọ iwọ kii yoo ni anfani lati lo ohun elo naa.
4. Top imo ipele
MIQE (8) -qPCR afọwọsi
Eyi ni ayo oke ti qPCR!Nitorina ọpọlọpọ awọn akọni ti ṣubu sinu iyanrin nibi.Nitoribẹẹ, o tun ṣee ṣe pe o ni orire ati awọn jiini ti o ṣe iwadi jẹ rọrun, nitorinaa o ṣan omi nipasẹ iho yinyin lẹgbẹẹ afẹfẹ.Alaye ijẹrisi ti qPCR jẹ ipinnu lati ṣe idanwo igbẹkẹle ti data naa.A ṣe atokọ alaye ijẹrisi pataki bi atẹle:
1.Specificity igbeyewo
Ni pato ti imudara jiini ibi-afẹde ni idanwo nipasẹ ṣiṣe ayẹwo boya aworan electrophoresis jẹ ẹgbẹ kan;ijerisi lesese;yo ti tẹ lati rii boya maapu tente jẹ ẹyọkan;Ijẹrisi tito nkan lẹsẹsẹ enzymu ati awọn ọna miiran.
Nibi, a fojusi lori to onínọmbà ti kii-kan pato ampilifaya lilo awọn ọna ti yo ekoro.Ni gbogbogbo, nigba ti a ṣe apẹrẹ awọn alakoko, iwọn ti ajẹkù ọja ni a nilo lati wa ni iwọn 80-200bp, eyiti o jẹ ki iwọn otutu yo ti ọja PCR jẹ iwọn 80-85 °C.Nitorinaa, ti o ba wa awọn oke giga oriṣiriṣi, awọn ọja imudara miiran ti ko ni pato gbọdọ wa;ti tente oke ba han ni isalẹ 80°C, gbogbo rẹ ni a ka pe o jẹ dimer alakoko;ti tente oke ba han loke 85°C, gbogbo igba ni a gba pe o jẹ ibajẹ DNA tabi diẹ sii Ailokun ti kii ṣe pataki ti awọn ajẹkù nla.
Akiyesi: Nigba miiran tente kan nikan wa ni 80 ° C.Ni akoko yii, ero yii gbọdọ wa ni ibamu si.O ṣeese pe awọn abajade imudara jẹ gbogbo awọn dimer alakoko.
Iyipada yo deede (tente ẹyọkan ti ko si imudara ti kii ṣe pato)
Iṣoro yo ti tẹ (afikun ti kii ṣe pato ti awọn oke giga spurious)
【Itupalẹ ọran】
Oke akọkọ wa, ṣugbọn dimer alakoko jẹ pataki
Iwọn yo ti o ga julọ ni nọmba ti o wa ni isalẹ le tàn awọn oju rẹ ni rọọrun, lerongba pe o jẹ idanwo pipe, ṣugbọn abajade jẹ aṣiṣe patapata.Ni akoko yii, a ni lati wo iwọn otutu yo.Iwọn otutu ti o ga julọ wa labẹ 80 ° C, eyiti o jẹ alakoko-dimer patapata.
Ko si ajeku ibi-afẹde, gbogbo awọn dimers alakoko
Nibi, arakunrin mi ko le duro.Aworan ti o wa ni isalẹ jẹ fọto ti o ya pẹlu foonu alagbeka ti a fi ranṣẹ si mi nipasẹ onibajẹ.Awọn reagents ti o lo jẹ gbogbo awọn ami iyasọtọ ti a lo ni ile-iṣẹ naa.O yipada lati ami ami ami-ipele T kan si ami ami ami-ipele T-ipele miiran.Mo ro pe o ti sọ tẹlẹ.Ẹ̀ṣẹ̀ náà kígbe sí mi pé: “Ẹ̀rọ amúnáwá tí a lò nínú àwòrán àkọ́kọ́ dára jù, góńgó náà sì jẹ́ àpọ́n.Nigbamii, lẹhin lilo reagenti ti o ṣeduro, o dabi aworan keji, pẹlu awọn oke alapọpo.O ti ṣe mi ni ibanujẹ."
Ya awọn meji awọn aworan.Ni wiwo akọkọ, ọkan ni tente oke kan, ati ekeji ni tente oke meji.Ọrọ isọkusọ, tente oke kan jẹ dajudaju itanran.Ṣe otitọ niyẹn?
Buru ju Dou E, ti MO ba fi awọn aworan meji si aworan ni isalẹ, iwọ yoo loye lẹsẹkẹsẹ.Ni otitọ, a ni irọrun rọ nipasẹ iru aworan yii.Lẹhin itupalẹ iṣọra, a rii pe: oke ti nọmba akọkọ wa ni 75 ° C, eyiti o jẹ dimer alakoko patapata;tente oke ti nọmba keji han ni 75°C ati 82°C, o kere ju nibẹ ni ọja naa han.
Awọn aworan ti esi lati omo ile
Nitorinaa iṣoro ipilẹ kii ṣe iṣoro ti awọn reagents, ṣugbọn iṣoro ti apẹrẹ alakoko.Ni akoko kanna, o tun fihan pe diẹ ninu awọn burandi nla kii ṣe didara irin, ati pe o tun jẹri ohun ti arakunrin mi sọ tẹlẹ: Kii ṣe ami iyasọtọ reagent ti o ṣe atilẹyin nkan rẹ.O jẹ nkan rẹ ti o ṣe agbega ami iyasọtọ ti awọn reagents.Fojuinu, ti o ba jẹ pe scumbag ko yi awọn reagents pada, data ti ko tọ yoo firanṣẹ si iwe akọọlẹ, ati pe ohun ti yoo ṣẹlẹ yoo jẹ ajalu.
2. Ct iye iṣakoso ofo
Maṣe ṣe alaye, ti iṣakoso ofo ba ni iye Ct, kii ṣe idoti?Sibẹsibẹ, o tun nilo lati ni oye iru iṣakoso ofo ni iye Ct kan.Ti o ba jẹ NTC, o tumọ si pe DNA ajeji wa gẹgẹbi ibajẹ reagent.Ti o ba jẹ NRT, o tumọ si pe RNA ti a fa jade ni DNA.
3. Standard ti tẹ
Pẹlu ite ati agbekalẹ iṣiro, ṣiṣe PCR le ṣe iṣiro nipasẹ agbekalẹ.Ṣàdánwò pípé kan nílò ìpele ìdìpọ̀ òdíwọ̀n láti sún mọ́ 3.32, àti R² láti sún mọ́ 0.9999.
4. Linear ìmúdàgba ibiti
Iwọn agbara ti iṣesi jẹ laini.Ni ibamu si awoṣe ti a lo lati ṣe ipilẹṣẹ ọna kika boṣewa, iwọn agbara yẹ ki o pẹlu o kere ju awọn gradients ifọkansi 5, ki o san ifojusi si iyipada ti awọn iye Ct ni awọn gradients ifọkansi giga ati awọn gradients ifọkansi kekere.
5. išedede wiwa
Awọn iyipada ninu awọn abajade qPCR, iyẹn ni, atunṣe ti ko dara, iyẹn ni, konge ko dara, jẹ nitori ọpọlọpọ awọn okunfa, pẹlu iwọn otutu, ifọkansi, ati iṣẹ.konge qPCR ni gbogbogbo di iṣakoso diẹ sii bi nọmba ẹda ti n dinku.Bi o ṣe yẹ laarin iyatọ-esiperimenta, iyatọ imọ-ẹrọ yẹ ki o jẹ iyatọ si iyatọ ti ẹda, ati awọn ẹda ti ẹda le koju awọn iyatọ iṣiro taara ni awọn abajade qPCR laarin awọn ẹgbẹ tabi awọn itọju.Ni pato fun awọn ayẹwo iwadii aisan, iṣedede laarin-ayẹwo ti o dara julọ (atunṣe) kọja awọn aaye ati awọn oniṣẹ gbọdọ jẹ ijabọ.
6. Ṣiṣe wiwa ati LOD (ni multiplex qPCR)
LOD jẹ ifọkansi ti o kere julọ ti 95% ti awọn ayẹwo rere ti a rii.Ni awọn ọrọ miiran, ifọkansi ti LOD ti o wa laarin eto awọn ẹda apilẹṣẹ ibi-afẹde ko yẹ ki o kọja 5% ti awọn aati ti kuna.Nigbati o ba n ṣe itupalẹ qPCR multiplex, paapaa fun wiwa igbakanna ti awọn iyipada ojuami tabi awọn polymorphisms, multiplex qPCR nilo lati pese ẹri pe deede ti awọn ajẹkù ibi-afẹde pupọ ko ni ipalara ninu tube kanna, wiwa pupọ ati wiwa wiwa tube ẹyọkan ati LOD yẹ ki o jẹ kanna.Paapa nigbati awọn jiini ibi-afẹde giga-giga ati awọn jiini ibi-afẹde kekere ti wa ni imudara nigbakanna, iṣoro yii gbọdọ wa ni akiyesi si.
Awọn iṣoro ati awọn solusanNi gbogbogbo, awọn iṣoro nigbagbogbo ti o ba pade ni qPCR n ṣatunṣe idojukọ lori awọn aaye wọnyi:
· amúṣantóbi ti ko ni pato
· Yiyan ti o nira ti ifọkansi alakoko ati wahala pẹlu alakoko-dimers
· Iwọn otutu mimu ko pe
· Atẹle eto yoo ni ipa lori ṣiṣe imudara
nonspecific ampilifaya
ti kii-kan pato ampilifayawaye , o jẹ akiyesi gbogbogbo boya apẹrẹ alakoko ko dara, ṣugbọn ti o ko ba yara lati yi awọn alakoko pada, o le gbiyanju awọn ọna wọnyi ni akọkọ (ipilẹ naa tun somọ):
Mu iwọn otutu annealing pọ si - gbiyanju lati ṣe awọn ifunmọ hydrogen alailagbara ti ko le ṣetọju;
· Kukuru annealing ati elongation akoko – din ni anfani ti hydrogen ìde;
· Din ifọkansi alakoko dinku - dinku anfani ti abuda ti awọn alakoko laiṣe ati awọn agbegbe ti kii ṣe ibi-afẹde;
Low ampilifaya ṣiṣe
Ipo idakeji si amúṣantóbi ti kii ṣe pato – iṣiṣẹ imudara kekere, ati awọn igbese lati wo pẹlu ṣiṣe imudara kekere jẹ idakeji:
· Mu akoko imuduro ati gigun gigun;
· Yipada si PCR-igbesẹ mẹta ati dinku iwọn otutu annealing;
· Mu ifọkansi alakoko pọ si;
Ps: Ọpọlọpọ awọn ọmọ ile-iwe giga ti a bi ni awọn ọdun 90 ko fẹ lati kawe bi o ṣe le ṣatunṣe awọn adanwo, ati nireti pe kit naa le yanju iṣoro naa patapata (ti o ba fẹ lọ si ile-iṣẹ reagent lati ṣe iwadii ati idagbasoke lẹhin ayẹyẹ ipari ẹkọ), ni otitọ, awọn olupilẹṣẹ reagent tun ronu ni ọna yii, Mo nireti pe o jẹ aṣiwere O le ṣee lo nigbati o ba gba, nitorinaa reagent ti awọn aṣelọpọ ti ko ni agbara lati yanju iṣoro ti ko lagbara, ti awọn aṣelọpọ ti ko lagbara lati yanju iṣoro naa. H-mnu gbigba ifosiwewe.Lati yanju iṣoro naa ni irọrun, awọn aṣiwere tun ni lati ka ifihan ti ile-iṣẹ reagent lati rii boya ifosiwewe kan wa ti o fa awọn ifunmọ hydrogen alailagbara.
Yiyan iṣoro ti ifọkansi alakoko ati wahala pẹlu alakoko-dimers
Ọna 1Ni gbogbogbo, awọn itọnisọna kit fun qPCR ni awọn eto iṣeduro ati awọn ifọkansi alakoko ti a ṣeduro.
Ọna 2: N ṣatunṣe aṣiṣe nipa siseto imudara ifọkansi alakoko.Aworan ti o wa ni isalẹ wa ni ji lati ile-iṣẹ kan lati ṣe apejuwe.Nọmba ti o wa ni isalẹ ṣe afihan awọn abajade iwọn fluorescence ti a ṣe pẹlu awọn gradients ifọkansi alakoko mẹta (100nM, 250nM, 500nM) ati awọn iwọn ifọkansi awoṣe mẹrin (0.1ng, 1ng, 10ng, 100ng).Iye Ct ti awọn abajade esiperimenta jẹ igbero bi atẹle:
Aṣayan Ifọkansi Alakoko Ṣapọpọ ifọkansi alakoko kọọkan sinu laini kan bi atẹle:
Yiyan ifọkansi alakoko jẹ kedere, ibatan laini ti ifọkansi alakoko ti 100nM ati 250nM dara julọ, ati ibatan laini ti ifọkansi alakoko ti 500nM jẹ talaka.Ni 100nM ati 250nM, iye Ct ti 250nM kere diẹ, nitorinaa ifọkansi alakoko ti o dara julọ jẹ 250nM.Ni gbogbogbo awọn alakoko-dimers ti o lagbara ni a le rii ni ọna yo.Kini ti awọn alakoko ti a ṣe apẹrẹ ko ba le yago fun alakoko-dimers?
Ọna 3: Dinku iye awọn alakoko ati mu iwọn otutu annealing (ko si ye lati ṣe alaye).
Iwọn agbara ti iwọn otutu annealing jẹ 60 ° C.Ti o ko ba ni idaniloju, bawo ni a ṣe le yan iwọn otutu annealing ti o dara julọ?Idahun si jẹ kanna bi yiyan ti ifọkansi alakoko -igbeyewo itesiwaju.Ya aworan kan lati ile-iṣẹ Bio-rad lati ṣe apejuwe iṣoro naa.Fun amúṣantóbi ti ajẹkù ibi-afẹde kan, ṣeto awọn iwọn iwọn otutu mẹjọ, ọkọọkan pẹlu awọn atunwi mẹta, ati ọna imudara ti o gba jẹ bi atẹle:
Yiyan iwọn otutu annealing:
· 70°C, 69°C — Ni ipilẹ, awọn alakoko ko le ṣe idapo, nitorinaa ko si imudara.
· 67.3 ° C - Iwọn titobi kekere wa ni ibẹrẹ, ati pe iye Ct jẹ iwọn nla.
· 64.5°C——Iye Ct dinku.
Ni 60.7°C, 58.0°C, 56.2°C, ati 55.0°C, awọn iye Ct ni ipilẹ ti nifẹ lati jẹ iduroṣinṣin, ṣugbọn awọn iye fluorescence ikẹhin yatọ.
Bawo ni lati yan?Ilana: Ilana akọkọ jẹ iye Ct ti o ga julọ.Fun iye Ct kanna, yan iwọn otutu annealing ti o ga lati yago fun dimerization ati imudara ti kii ṣe pato.Botilẹjẹpe iye fluorescence ti o ga julọ wa ni 55°C, awọn dimers le wa tabi ampilifisi ti kii ṣe pato ninu rẹ.
Ṣugbọn ti o ba jẹ ọlọgbọn bi iwọ, iwọ yoo ronu ni pato: Ni sisọ ni otitọ, ti iṣe PCR ba jẹ pato, niwọn igba ti ifọkansi alakoko ba kọja ibeere ti o kere ju, awọn aaye giga ati kekere ko yẹ ki o ni ipa, gẹgẹ bi awọn awọ fluorescent ati awọn dNTP.Lootọ, niwọn igba ti iwọn otutu annealing ti wa ni iṣapeye daradara, ipa ti ifọkansi alakoko lori iye Ct yoo dinku nipa ti ara.
Awọn iwọn otutu annealing ti wa ni iṣapeye daradara, ati pe ipa ti ifọkansi alakoko lori CT yoo dinku
Eto ile-iwe keji ni ipa lori ṣiṣe imudara
Jẹ ki a ya aworan lati Bio-rad lati ṣe apejuwe iṣoro naa.O tun ṣe apẹrẹ iwọn otutu lati mu jiini pọ si pẹlu eto atẹle kan.
Atẹle be farahan
O le rii pe bi iwọn otutu ti dinku, awọn ọja bẹrẹ lati han ati pe iye Ct n lọ siwaju, ti o de iye ti o kere julọ ni 60.7 ° C, ati lẹhinna bi iwọn otutu ti dinku, iye Ct yoo tobi.Lọna miiran, bi iwọn otutu ṣe n pọ si, eto atẹle yoo ṣii ati ṣiṣe imudara pọsi.Lẹhin ti o de iwọn otutu kan, jijẹ iwọn otutu ko le mu imudara imudara pọ si.Nitoripe awọn alakoko ko le ṣe idapo ni iduroṣinṣin ni akoko yii.Nítorí náà,wa iwọn otutu pẹlu iye Ct ti o kere julọ, eyiti o jẹ iwọn otutu ti o dara julọ fun imudara awoṣe igbekalẹ Atẹle!Nitoribẹẹ, awọn aṣiwere ọlọgbọn gbọdọ mọ pe ti ko ba jẹ dandan, o dara julọ lati yi awọn alakoko pada ki o yago fun agbegbe igbekalẹ keji.
5. Ipele ohun elo
MIQE-Itupalẹ data
Onínọmbà data jẹ ni pataki nipasẹ ohun elo PCR pipo Fuluorisenti.Ninu nkan ti tẹlẹ, ọpọlọpọ awọn iṣẹ itupalẹ data ti ṣe, gẹgẹbi iṣakoso ofo, eyiti a ti ṣalaye ninu apẹrẹ ti idanwo naa.Awọn Jiini itọkasi inu, awọn nọmba atunwi, ati bẹbẹ lọ ti ṣe alaye., Nibi a ṣe alaye nipataki ohun elo ti qPCR.
qPCR jẹ lilo pupọ, ati iṣeduro idanwo ati iwadii nucleic acid jẹ awọn oju iṣẹlẹ ti o wọpọ julọ ti a lo.
idi pipo
Wọle (ifojusi ibẹrẹ) ni ibatan laini pẹlu nọmba awọn iyipo.Ipilẹ boṣewa le jẹ iyaworan lati boṣewa kan pẹlu nọmba ẹda akọkọ ti a mọ, iyẹn ni, ibatan laini ti imudara imudara le ṣee gba.Gẹgẹbi iye Ct ti ayẹwo, ifọkansi ninu apẹẹrẹ le ṣe iṣiro.Awọn iye ti awọn awoṣe lati ni.
Ọna Iṣiro Pipo pipe
Isọdiwọn pipe gbọdọ wa ni ipilẹ lori ọna ti o yẹ.Lati ṣe ohun ti tẹ boṣewa, a nilo boṣewa kan.Nigbagbogbo, boṣewa jẹ plasmid kan ti a gba nipasẹ didin jiini ibi-afẹde.Kini idi ti o jẹ plasmid?Nitori DNA plasmid ipin jẹ iduroṣinṣin julọ.Di ọja boṣewa ni awọn gradients 5 si 6 ni ibamu si ipin ilọpo meji (dilution-agbo 10), ki o fiyesi si iṣọkan nigbati o ba fomi.Jẹ ki iye Ct ṣubu laarin 15-30.
Standard igbaradi
Ni akoko kanna, ayẹwo lati ṣe idanwo yẹ ki o tun ti fomi ni ibamu (ranti ifosiwewe dilution), ati pe iye Ct yẹ ki o tun ṣubu laarin 15-30.Ọja boṣewa + apẹẹrẹ lati ṣe idanwo ni a fi sori ẹrọ papọ.Lẹhin ṣiṣe naa, a ṣe iwọn ti o ni idiwọn pẹlu nkan ti o ṣe deede, ati pe awọn ayẹwo lati ṣe idanwo ni a mu wa sinu igbọnwọ boṣewa lati ṣe iṣiro ifọkansi naa.
Ẹdọjẹdọ B virus HBV quantification jẹ aṣoju ididiwọn deede, eyiti o le ṣe iṣiro nọmba ẹda kokoro ni 1 milimita ti ẹjẹ.
Iṣiro nọmba ẹda
Idojukọ ayẹwo lati ṣe idanwo (ng/ul) = OD260 × 50ug/ml × ifosiwewe dilution
Ayẹwo molikula iwuwo = nọmba awọn ipilẹ × 324
Nọmba ẹda ti ayẹwo lati ṣe idanwo (awọn adakọ/ul) = ifọkansi ti ayẹwo lati ṣe idanwo / iwuwo molikula ti ayẹwo × 6 × 1014
Iṣiro ọna ti daakọ nọmba
Eyi ti o wa loke ni ọna iṣiro fun ṣiṣe ipinnu iye.Eyi jẹ iṣoro mathematiki ti o le yanju lẹhin ayẹyẹ ipari ẹkọ lati ile-iwe giga junior, ati pe awọn iṣoro mathematiki ni gbogbogbo nipasẹ kọnputa.Ti o ko ba loye, o le wa lati ba sọrọ.
ojulumo pipo
Iwọn ibatan jẹ lilo ni pataki ninu iwadii imọ-jinlẹ.Awọn ọlọjẹ melo ni o wa ninu 1 milimita ti ẹjẹ, ati pe o jẹ ọlọjẹ DNA, eyi jẹ iṣẹlẹ ipinnu ti o jo: iye ẹjẹ ni a le pinnu, ati pe ọlọjẹ DNA jẹ iduroṣinṣin.Bibẹẹkọ, o ṣoro fun wa lati ṣe afiwe nọmba awọn ẹda iwe-kikọ ti jiini kan ninu ewe kan, nitori o ṣoro lati pinnu iwọn, iwuwo, ati tutu ti ewe naa, iye RNA ti a fa jade nira lati pinnu, ati ṣiṣe ti transcription yiyipada tun nira lati pinnu, iyẹn ni lati sọ, eyikeyi igbesẹ le jẹ ki data esiperimenta ni awọn idun ati pe a ko le lo.
Nitorinaa, iwọn ibatan gbọdọ ṣafihan eroja kan:apilẹṣẹ itọkasi inu.
Ni awọn ọrọ miiran, iwọn ibatan jẹ gangan lafiwe laarin jiini ibi-afẹde ati apilẹṣẹ itọkasi inu.Ti a ṣe afiwe ninu ohun elo kanna ati sẹẹli kanna, ipa ti iwọn ayẹwo, iye isediwon RNA, ṣiṣe transcription yiyipada, ati ṣiṣe PCR jẹ kekere.Nitori iwọn ayẹwo kekere, mejeeji awọn jiini itọkasi inu ati awọn jiini ibi-afẹde ti dinku ni iwọn.Eyi ni idi ti a fi n tẹnuba iṣọkan ati iduroṣinṣin ṣaaju ki o to.
Awọn Jiini itọkasi inu jẹ gbogbogboawọn Jiini itọju ile(Awọn Jiini ti ntọju ile), eyiti o tọka si kilasi ti awọn Jiini ti o han ni iduroṣinṣin ni gbogbo awọn sẹẹli, ati awọn ọja wọn jẹ pataki lati ṣetọju awọn iṣẹ igbesi aye ipilẹ ti awọn sẹẹli.
Maṣe daamu ero yii.Awọn Jiini itọju ile jẹ awọn ofin iṣẹ ti ibi, lakoko ti awọn jiini itọkasi inu jẹ awọn ofin imọ-ẹrọ esiperimenta.Awọn Jiini itọju ile nilo lati kọja afọwọsi ṣaaju ki wọn le yan bi awọn jiini itọkasi inu.
Fun apẹẹrẹ, a yan ọpọlọpọ awọn Jiini itọju ile ni aworan ti o wa ni isalẹ lati ṣe idanwo awọn ipele ikosile wọn ni oriṣiriṣi awọn sẹẹli ti ara, ati rii pe awọn ipele ikosile ti β-2-microglobulin yatọ pupọ si ti awọn jiini mẹta miiran, nitorinaa wọn ko le lo bi awọn jiini itọkasi inu.
Lẹhin agbọye iṣẹ atunṣe ti apilẹṣẹ itọkasi inu, awọn algoridimu meji ti wa ni ipilẹṣẹ nitori ifihan ti jiini itọkasi inu.
· ilopo boṣewa ti tẹ ọna
· 2 – △△ Ct ọna (ọna afiwe iye CT)
Ti o ba nifẹ si kikọ awọn eya ati awọn iṣẹ jiini, jọwọ fi iwadi silẹ lori awọn algoridimu ki o lo awọn agbekalẹ taara, tabi lo awọn ẹrọ taara;ti o ba jẹ eniyan taara ni mathimatiki ati imọ-ẹrọ, jọwọ lero ọfẹ.
ė boṣewa ti tẹ ọna
Ṣe iwọn jiini ibi-afẹde ati jiini itọju ile ti apẹẹrẹ iṣakoso ati ayẹwo lati ṣe idanwo nipasẹ ọna kika boṣewa, ati lẹhinna ṣe iṣiro iye ibatan ni ibamu si agbekalẹ iṣiro, eyiti o jẹ ipele ikosile ibatan.
Awọn anfani: itupalẹ ti o rọrun, iṣapeye idanwo ti o rọrun
Alailanfani: Fun Jiini kọọkan, iyipo kọọkan ti awọn adanwo gbọdọ ṣe titẹ boṣewa kan
Ohun elo: Ọkan ninu awọn meji ti o wọpọ julọ ti a lo ati ti idanimọ awọn ọna pipo ojulumo ninu iwadi ti ilana ikosile pupọ
Ilana naa jẹ bi atẹle:
Awọn apẹẹrẹ jẹ bi atẹle:
Ṣe iṣiro iye ibatan ti o da lori abajade pipo
2 – △△ Ọna Ct (Ọna afiwe iye CT)
Awọn anfani: Ko si iwulo lati ṣe iwọn ti o yẹ
Awọn aila-nfani: A ro pe imudara imudara jẹ isunmọ si 100%;Iyapa boṣewa jẹ <5%, ati pe ọna kika boṣewa ati ṣiṣe laarin imudara kọọkan ni a ro pe o wa ni ibamu;iṣapeye awọn ipo idanwo jẹ idiju diẹ sii.
Ohun elo: Ọkan ninu awọn meji ti o wọpọ julọ ti a lo ati ti idanimọ awọn ọna pipo ojulumo ninu iwadi ti ilana ikosile pupọ
Nitoribẹẹ, ṣiṣe ampilifaya nigbagbogbo ko ṣee ṣe lati jẹ pipe 1. Ọna Atunse: Ti a ba mọ pe jiini ibi-afẹde ati jiini itọkasi ni imudara imudara kanna, ṣugbọn imudara imudara ko dọgba si 1, lẹhinna 2－△△ Ct le ṣe atunṣe bi: (1+E)－－－－－？－－－？－？－？－？－？－？－－－？－－－？－－？－－－？－－？－－－－－－－,－. agbekalẹ iṣiro le ṣe atunṣe si 1.95 △ △ Ct
Titi di isisiyi, akoonu nipa PCR pipo fluorescent ti de opin.
Akoko ifiweranṣẹ: Oṣu Kẹrin Ọjọ 06-2023
